本发明专利技术公开了一种水解牛乳过敏源β‑乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，提供一株生产水解牛乳过敏源β‑乳球蛋白蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis S7)，所述枯草芽抱杆菌S7经过发酵纯化后生成的蛋白酶可以有效的降解牛乳蛋白中的β‑乳球蛋白，蛋白酶的产量高，发酵方法简单，发酵培养基简单，发酵周期短，还能有效的消除其致敏性。
Isolation, Purification and Application of a Hydrolyzed Bovine Milk Allergen-beta-lactoglobulin Protease
The invention discloses the separation, purification and application of a hydrolyzed milk allergen beta-lactoglobulin protease, and provides a Bacillus subtilis S7 producing a hydrolyzed milk allergen beta-lactoglobulin protease. The protease produced by the fermentation and purification of Bacillus subtilis S7 can effectively degrade the beta-lactoglobulin and protease in milk protein. High yield, simple fermentation method, simple fermentation medium, short fermentation cycle, and can effectively eliminate its sensitization.
【技术实现步骤摘要】
一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用
本专利技术涉及一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，属于生物
技术介绍
奶中含有丰富的蛋白质，是人体生长重要营养品，但是食用牛奶也会引起人体的过敏反应。牛奶过敏主要是由特异IgE抗体介导的I型超敏反应，可引起呼吸道、消化道、皮肤或全身性过敏，主要表现为呕吐、腹痛和腹泻等肠胃不适，也有部分患儿发生血管水肿、荨麻疹、鼻炎、哮喘、过敏性昏厥等症状，对小肠粘膜和肝功能也有损伤，严重的影响婴幼儿对乳蛋白的吸收。牛奶蛋白主要由酪蛋白和乳清蛋白组成，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白是乳清蛋白的主要成分。β-乳球蛋白只存于牛奶而不存于人乳中，且能抗胃酸和抗蛋白酶水解，能直接通过胃肠道排出而进入血液循环，因此β-乳球蛋白被认为是牛奶中最主要的过敏原。目前消除牛奶过敏源的主要方法有高温、高压等物理方法、糖基化反应、乳酸菌发酵和蛋白酶水解。通过使用专一性的酶对乳制品进行降解，降低或消除蛋白质过敏原，而且不会影响产物的营养价值是其他改性方法所不及的，还可以改进产物的功能性，越来越多的商业化乳清蛋白水解物是利用酶类来生产的。由于乳清蛋白过敏原表位的广泛存在，在众多蛋白酶中筛选出合理酶有一定的盲目性，需要特异性的酶来降解过敏原的抗原决定部位，酶的选择是乳清蛋白改性的关键。目前市场上主要用作消除过敏源的酶主要为动物蛋白酶、植物蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等，但是它们对β-乳球蛋白的脱敏效果有限，最佳条件下的脱敏效果也只在50％以下，研究发现将这些酶结合起来利用时，水解乳清蛋白产生的水解物的过敏性比单独一种酶水解产生的要低，最佳脱敏效果能达到70％左右，但是几种不同来源的酶水解过程复杂且成本高，还可能产生苦味多肽，影响牛奶风味。直至目前，筛选、发掘、研究生产有水解牛乳过敏原蛋白酶能力的微生物菌株，以及继续开发这些菌株产的有潜在工业、商业应用潜力的蛋白酶资源，仍是牛乳过敏原研究中的重要的、待解决的问题。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一株生产水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisS7)，所述枯草芽抱杆菌S7，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心，分类命名为Bacillussubtilis。本专利技术第二个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶，所述蛋白酶是由草芽抱杆菌S7发酵生产，所述解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶N端的十个氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。本专利技术的第三个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的发酵生产方法，具体步骤如下：(1)将枯草芽抱杆菌S7接种至AM液体培养基或PDA液体培养基中，在35-39℃，180-260rpm培养10-16h得到种子液；(2)将种子液按体积2-5％接种量接种于液体培养基PDA液体培养基所述中，在35-39℃，180-260rpm发酵10-16h得到发酵液；(3)将发酵液离心，收集发酵液上清即为粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基A为，所述培养基B为。在本专利技术的一种实施方式中，AM液体培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42g/L，CaCl20.2g/L；所述PDA液体培养基成分为：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。本专利技术的第四个目的是提供一种水解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶的分离纯化及应用，具体步骤如下：(1)将枯草芽孢杆菌S7发酵培养获得的粗酶液；(2)将粗酶液用质量分数为40-70％的硫铵酸梯度沉淀出一部分杂蛋白后，用磷酸缓冲液透析，用磷酸缓冲液平衡QSepharosefast-flow离子交换柱，上样，收集有酶活的蛋白峰，用磷酸缓冲液透析，磷酸缓冲液平衡凝胶柱，上样，洗脱，收集有酶活的组分，即得纯化后的蛋白酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为pH6.0-9.0，40-60mM磷酸缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述磷酸缓冲液为pH8.0，50mM磷酸缓冲液。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术提供的菌株蛋白酶的产量高，发酵液蛋白酶酶活可达76.75U/mL，纯化后酶活可达11.36U/mL，发酵方法简单，发酵培养基简单，发酵周期短；(2)蛋白酶的性能优于现有传统的酶，对β-乳球蛋白的脱敏效果好，脱敏率可达80％，对牛乳中其他过敏源如α-乳白蛋白、酪蛋白也有很好的水解效果，水解生成功能性多肽，水解液物苦涩口感。(3)该蛋白酶分离纯化步骤简单，蛋白酶性质稳定。生物材料保藏枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S7，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号CCTCCNO:M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心。附图说明图1：菌株筛选图2：菌株S7生长曲线图3：酶液的一般酶学性质，最适pH(a)，pH稳定性(b)，最适温度(c),温度稳定性(d)图4：分离纯化的蛋白酶的SDS-PAGE检测图图5：蛋白酶与日本天野公司商业酶A2SD对β-乳球蛋白处理效果图6：ELISA检测日本天野的四个商业酶和本专利技术纯化的蛋白酶与β-乳球蛋白反应后的致敏性图7：蛋白酶处理α-乳白蛋白、酪蛋白后SDS-PAGE电泳分析图具体实施方式蛋白酶的酶活测定方法：参照我国现行GB1886.174——2016《食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂》蛋白酶测定方法进行测定。该法的原理是在一定的pH与温度条件下，蛋白酶水解酪蛋白底物，产生含有酚基的氨基酸，在碱性条件下还原福林酚试剂，生成钨蓝和钼蓝，用分光光度计测定溶液在波长680nm的光下的吸光度。酶活力与吸光度成比例，由此可以计算蛋白酶的酶活力。(1)绘制标准曲线L-酪氨酸标准溶液按表1-1配置。表1-1L-酪氨酸标准溶液分别取上述溶液各1.00mL，加入5.00mL碳酸钠溶液(42.4g/L)，1.00mL福林酚试剂，摇匀，于40℃水浴20min显色，用10mm比色皿，分光光度计测定其在波长680nm的吸光度。做三组平行实验，以酪氨酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制曲线。(2)测定酶活力将酪蛋白溶液(10.0g/L)置于40℃水浴预热5min。取干净且干燥的试管，按表1-2中的顺序加试剂进行操作。表1-2蛋白酶检测方法Table1-2Proteasedetectionmethod(3)酶活力计算经标准曲线和酶活力定义得到酶活力的计算公式：酶活力(E)＝(A×V×4×n)/10(1-1)式中A——由标准曲线得出的酪氨酸含量(μg/mL)；V——样品的体积(mL)；4——反应体系的体积(mL)；n——稀释倍数；10——反应时间(min)。培养基成分AM液体培养基：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42g/L，CaCl20.2g/L。PDA液体培养基：葡萄糖20g/L，马铃薯200g/L。实施例1枯草芽孢杆菌的分离纯化该专利技术所用的菌种筛自于无锡马山牧场，从泥土和水中获取了3000多株野生菌，然后以无脂牛奶培养基筛选得到了30株能够降解蛋白的菌株(图1)，然后再将菌株产的粗酶直接与本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)S7，其特征在于，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号CCTCC NO:M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心。
【技术特征摘要】
1.一株产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)S7，其特征在于，于2016年9月27日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号CCTCCNO:M2016532，保藏地址为武汉大学保藏中心。2.应用权利要求1所述的枯草芽孢杆菌S7发酵生产水解牛乳过敏源β-乳球蛋白的蛋白酶的方法，其特征在于，所述蛋白酶是由草芽抱杆菌S7发酵生产，所述解牛乳过敏源β-乳球蛋白蛋白酶N端的十个氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)将枯草芽抱杆菌S7接种至AM液体培养基或PDA液体培养基中培养得到种子液；(2)将种子液按体积2-5％接种量接种于液体培养基PDA液体培养基中发酵培养得到发酵液。(3)将发酵液离心，收集发酵液上清即为粗酶液。4.根据权利要求3所述的发酵方法，其特征在于，所述AM液体培养基成分为：葡萄糖10g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，MgSO40.5g/L，KH2PO42g/L，CaCl20.2g/L；所述PDA液体培养基成分为：葡萄糖20g/L，马铃薯...
【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，郑天飞，堵国成，陈坚，汤恒，杨佩珊，马浩，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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