玉红霉素类似物、制备方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及新型玉红霉素类似物及制备方法和应用。本发明专利技术提供了四种新的结构的玉红霉素类似物，其结构式如式(I)所示：本发明专利技术制备的化合物3、8具有较好的肿瘤抑制活性，可以用于制备抗肿瘤药物。尤其是化合物3，其活性远远优于相似化合物1，同时也远优于阳性抗肿瘤西药对照组的活性，证明其在未来的抗肿瘤药物中的应用有非常好的前景。肿瘤药物中的应用有非常好的前景。

【技术实现步骤摘要】
Streptomyces sp.CB00271的基因组中的orf9基因基因敲除后获得的基因工程菌株，所述基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06是将链霉菌Streptomyces sp.CB00271的基因组中的 orf4基因基因敲除后获得的基因工程菌株；所述的orf9基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，所述的orf4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物3是用链霉菌Streptomyces sp.CB00271菌株发酵制备，具体过程为：
[0010]S1、发酵：取链霉菌Streptomyces sp.CB00271孢子接种到含有50mL胰蛋白大豆肉汤(TSB)的培养基中培养1-2天，后将其按照4％的接种量接种到mR2A培养基中继续培养7天，调整发酵液pH调至10-11，继续反应12h，然后调整反应后的发酵液pH 至3-4后，析出红色沉淀，离心收集沉淀和菌体，将沉淀和菌体用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；
[0011]S2、分离：将粗提物溶解，第一次过硅胶色谱柱，洗脱，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)；对Fr.3第二次过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.3.1-Fr.3.5)；将Fr.3.2采用半制备型HPLC 分离，得到化合物3。
[0012]优选的，用饱和NaOH溶液调整发酵液pH调至10-11。
[0013]优选的，用饱和NaOH溶液调整发酵液pH调至11。
[0014]经过试验探索，发现mR2A培养基中发酵7天后上清产物只有化合物1和少量3，随着发酵天数增加，化合物3逐渐增加，这是因为在碱性条件下，化合物1可以在12 小时内完全转化为化合物3。
[0015]本专利技术中所有化合物的结构式如式(Ⅱ)所示：
[0016][0017]优选的，所述S1中混合溶剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂，所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇以1:1混合。
[0018]所述混合溶剂对沉淀的溶解性明显比其他纯溶剂或者其他比例的混合溶剂的溶解性要好。
[0019]优选的，粗提物溶解的溶剂为二氯甲烷。
[0020]优选的，所述S2中第一次过硅胶色谱柱的目数为300-400目。
[0021]优选的，所述S2中洗脱为梯度洗脱，依次采用二氯甲烷与甲醇质量比为100:0、99:
1、 98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10的混合溶液梯度洗脱。
[0022]根据不同梯度洗脱下来的成分不一样，依次10个比例的混合溶剂依次洗脱，最大程度的洗掉杂质，富集目标化合物。
[0023]优选的，所述S2中第二次过硅胶色谱柱的目数为200目。
[0024]两次过硅胶色谱柱的目数不一致，第一次是粗分，第二次是细分。
[0025]优选的，mR2A培养基组成为：0.5g/L葡萄糖、0.5g/L蛋白胨、0.5g/L酵母提取物、0.5g/L酸水解酪蛋白、0.3g/L丙酮酸钠、0.025g/L MgSO4·
7H2O、0.5g/L K2HPO4， pH 7.0。
[0026]优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物4是用基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02 发酵制备，具体过程为：
[0027]A、发酵：将基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02接种到含有硫链丝菌的R2A平板上7-9 天后，取孢子接种到TSB培养基中培养1-2天，后按照4％的接种量接种到mR2A 培养基中继续培养7天，将发酵液pH调至3-4，析出红褐色沉淀，离心收集沉淀和菌体，用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；
[0028]B、分离：将粗提物溶解，过硅胶色谱柱，洗脱，得到五个组分(Fr.1-Fr.5)；将Fr.2和 Fr.3合并再过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)；进一步分离Fr.2.4，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物4。
[0029]优选的，进一步分离Fr.2.4，使用半制备型HPLC，同时可分离得到化合物5。
[0030]化合物4的保留时间为12.002min，其m/z 511.0875[M+H]+，HRESIMS确定其分子式为C
25
H
18
O
12
，化合物5的保留时间为14.331min，其(m/z 495.0923[M+H]+)， HRESIMS确定其分子式为C
25
H
18
O
11
。根据分子量和特征紫外吸收，可以确定化合物5为7,8-dideoxygriseorhodin C，而化合物4比化合物5多了一个羟基，进一步通过C谱和H谱分析及与以前的化合物进行对比，确化合物4的结构如图1，是一个新的玉红霉素类似物。
[0031]优选的，上述玉红霉素类似物中，化合物8和11是用基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06发酵制备，具体过程为：
[0032]C、发酵：将基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06接种到含有硫链丝菌的R2A平板上7-9 天后，取孢子接种到TSB培养基中培养1-2天，后按照4％的接种量接种到mR2A 培养基中继续培养7天，将发酵液pH调至3-4，析出红褐色沉淀，离心收集沉淀和菌体，用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；
[0033]D、分离：将粗提物溶解，过硅胶色谱柱，洗脱，得到8个组分(Fr.1-Fr.8)；将Fr.2和 Fr.3合并再过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.2.1-Fr.2.5)；合并Fr.2.2和Fr.2.3进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物10以及化合物11；合并 Fr.4和Fr.5进行进一步分离，使用半制备型HPLC，最终分离得到化合物8和化合物9。
[0034]本专利技术还提供了所述的化合物3，4，8和11在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0035]本专利技术通过对原始菌株链霉菌Streptomyces sp.CB00271用mR2A培养基进行发酵，经过UPLC-MS的分析其次级代谢产物。以UPLC程序进行分析，分析结果显示，在原始菌株中可以生产多个玉红霉素类似物。经HRLCMS分析，在保留时间在13.342min 处并有特征紫外吸收值(λmax 238nm,309nm和508nm)的峰3，其m/z 523.0876[M+H]+，在保留时间为14.051min处并有特征紫外吸收值(λmax 236nm,316nm和496nm)的峰6，其(m/z 555.31[M+H]+)，在保留时间为14.431min处并有特征紫外吸收值(λmax 231nm, 312nm和512nm)的峰
9，其(m/z 553.0982[M+H]+
)，在保留时间为15.590min处并有特征紫外吸收值(λmax 239nm,313nm和513nm)的峰1，其(m/z 537.1035[M本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.玉红霉素类似物，其特征在于，其结构式如式(I)所示：2.如权利要求1所述的玉红霉素类似物的制备方法，其特征在于，所述制备方法是用链霉菌Streptomyces sp.CB00271菌株、基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02或基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06发酵制备，所述基因工程菌株Streptomyces sp.ZX02是将链霉菌Streptomyces sp.CB00271的基因组中的orf9基因基因敲除后获得的基因工程菌株，所述基因工程菌株Streptomyces sp.ZX06是将链霉菌Streptomyces sp.CB00271的基因组中的orf4基因基因敲除后获得的基因工程菌株；所述的orf9基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的orf4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，如权利要求1所述的玉红霉素类似物中，化合物3是用链霉菌Streptomyces sp.CB00271菌株发酵制备，具体过程为：S1、发酵：取链霉菌Streptomyces sp.CB00271孢子接种到胰蛋白大豆肉汤培养基(TSB)中培养1-2天，后将其按照4％的接种量接种到mR2A培养基中继续培养7天，调整发酵液pH调至10-11，继续反应12h，然后调整反应后的发酵液pH至3-4后，析出红色沉淀，离心收集沉淀和菌体，将沉淀和菌体用混合溶剂超声提取，将提取液旋干，得到粗提物；S2、分离：将粗提物溶解，第一次过硅胶色谱柱，洗脱，得到四个组分(Fr.1-Fr.4)；对Fr.3第二次过硅胶色谱柱，得到5个组分(Fr.3.1-Fr.3.5)；将Fr.3.2采用半制备型HPLC分离，得到化合物3。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，用饱和NaOH溶液调整发酵液pH调至10-11。5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S1中混合溶剂为二氯甲烷和甲醇混合溶剂，所述混合溶剂中二氯甲烷和甲醇以1:1混合。6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述S2中洗脱为梯度洗脱，依次采用二氯甲烷与甲醇体积比为100:0、99:1、98:2、97:3、96:4、95:5、94:6、93:7、92:8、91:9、90:10的混合溶液梯度洗脱。7.根据权...

【专利技术属性】
技术研发人员：段燕文，朱湘成，易理伟，
申请(专利权)人：长沙天赐生物医药科技有限公司长沙慈航药物研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：