一种囊尾蚴体外培养方法技术

本发明专利技术提供一种囊尾蚴体外培养方法，特别是一种豆状囊尾蚴离体培养方法。本发明专利技术的方法是：从宿主动物体内分离完整的囊尾蚴清洗干净后，转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。本发明专利技术有效解决了豆状囊尾蚴离体长时间存活的问题，可以便捷地获得充足的研究材料，虫体体外存活时间长，可满足药物筛选及药理评价的筛选周期，同时可直接观察虫体‑药物作用。本发明专利技术的培养不依赖于宿主，实验背景易于控制，可对幼虫阶段具体实验做出较正确的评估。

A method for culture of cysticercus in vitro

The invention provides an in vitro culture method of cysticercus, in particular a method for in vitro culture of Cysticercus lenticularis. The method of the present invention is: after cleaning the complete cysticercus from the host animal, the cysticercus is transferred into the culture container with culture liquid added thereto, the culture container is placed in the carbon dioxide cell culture box, and cultured under the conditions of 37 C, 5% CO2 concentration and 70% relative humidity. The cysticercus is changed once at the 6th and 12th hours after the beginning of the culture, and the obsolescence is removed as far as possible at each time of changing the liquid. The culture medium was added with fresh complete culture medium 8ml/bottle/time, and then changed every 48h. The invention effectively solves the problem of long-term survival of Cysticercus lenticularis in vitro, can conveniently obtain sufficient research materials, has long survival time in vitro, can meet the screening cycle of drug screening and pharmacological evaluation, and can directly observe the drug action of the cysticercus lenticularis. The culture of the present invention does not depend on the host, the experimental background is easy to control, and the specific experiment of larval stage can be correctly evaluated.

【技术实现步骤摘要】
一种囊尾蚴体外培养方法
本专利技术涉及一种寄生虫体外培养方法，本专利技术所述的寄生虫培养方法是指囊尾蚴体外培养方法，特别是一种豆状囊尾蚴离体培养方法。
技术介绍
囊尾蚴病是一种常见的寄生虫病，其分布范围广泛，严重威胁畜牧业发展和公共卫生安全。其中的豆状囊尾蚴病是由豆状带绦虫的中绦期幼虫-豆状囊尾蚴寄生于兔体内而引起的一种常见寄生虫病。在我国，家兔平均感染率高达40％，死亡率4.0％～23.69％，严重威胁养兔业的发展。豆状囊尾蚴主要寄生于家兔的肝脏、胃网膜、肠系膜或直肠后壁；大量感染时导致病兔肝脏损害，临床表现消化紊乱、食欲不振、精神沉郁、消瘦、贫血等症状，严重时突然死亡；此外可继发巴氏杆菌病等，导致家兔饲料回报率降低，经济效益下降。豆状带绦虫生活史复杂，其完整生活史需要转换2个宿主才能完成。成虫通常寄生于犬类小肠内，虫卵在成虫孕节内发育，并随孕节脱落释放到外界环境中，污染食物或水源。虫卵被兔吞食后随血流到达肝脏并移行至大网膜、肠系膜等处发育为感染性豆状囊尾蚴。目前我国对该病的防治仍面临很大的难题，亟需筛选和挖掘特异药物靶标及疫苗候选分子，为该病的有效防控和根治提供新手段。随着寄生虫功能基因组的大规模研究发展，基因功能验证及新型药物分析成为了当前寄生虫研究的瓶颈。在豆状带绦虫研究方面，无有效的稳定细胞系可供利用，也尚未建立可行的体外评价模型。体外培养是寄生虫学研究中一个极具价值的技术平台，可在直观和可控条件下进行寄生虫抗原、药物作用、免疫效应及寄生虫与宿主相互作用等相关研究。近几十年来，随着培养方法不断改进与提高，通过模仿宿主机体的某些因素与条件进而建立适宜的培养方法，促进了寄生虫人工培养技术研究的发展。然而，寄生虫种类繁多，生活史复杂，无通用培养液或统一培养方法对寄生虫进行体外培养。相对于原虫、吸虫和线虫，绦虫体外培养技术的研究进展较为缓慢。目前，用于豆状囊尾蚴研究的活虫样本，主要采集于自然或实验感染的家兔，该方法存在如下缺点：(1)借助犬-兔循环感染保虫方法成本高，工作量大，费事费力，投入人员多；在安全性及经济性方面存在问题。另外，保虫试验周期长，一般需要4个月左右才能完成。(2)依靠家兔体内囊尾蚴活虫样品不便于在直观或可控条件下进行药物筛选和药效评价等研究。(3)依靠家兔体内囊尾蚴活虫样品不能随时收集足量的代谢分泌抗原或外泌体。因此，提供一种可行和稳定的豆状囊尾蚴体外培养方法，可大大缩短科研时间和成本，有助于体外进行抗原收集、药物筛选及药物杀虫效果分析等研究；对于带绦虫的研究及其防治技术研究具有重要的学术价值和应用意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种有效的囊尾蚴离体培养方法，本专利技术特别提供一种可实现豆状囊尾蚴离体长时间存活的囊尾蚴培养方法。另外，本专利技术还提供一种便于进行豆状囊尾蚴代谢分泌抗原制备、外泌体制备、虫体代谢检测、药物筛选等需要的豆状囊尾蚴体外培养方法，利用本专利技术的方法培养的虫体可有利于进行代谢分泌抗原制备、外泌体制备、虫体代谢检测、药物筛选等。亦可作为研究其他重要绦虫基因功能的替代模型，如猪囊尾蚴病、牛囊尾蚴病等。但体外培养过程仅保持囊尾蚴幼虫形态，不涉及体外培养幼虫发育为成虫。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：囊尾蚴离体培养方法，首先从宿主动物体内分离完整的囊尾蚴，在无菌条件下用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。本专利技术的一种豆状囊尾蚴离体培养方法是：从感染兔的腹腔中新鲜分离完整的豆状囊尾蚴在无菌条件下，用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。优选地，本专利技术的豆状囊尾蚴离体培养方法中，所用的PBS中加有100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，所述的培养液为其中添加有胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640培养液，其中：胎牛血清含量为10％(v/v)；所述抗生素终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，两性霉素B1.25μg/mL；所述L-谷氨酰胺终浓度为2.5mM；加入碳酸氢钠调整培养液pH为7.2～7.4。优选地，本专利技术的豆状囊尾蚴离体培养方法，其初始培养液的加入量为：6孔板加入量为3ml/孔，或者细胞瓶加入量为8ml/(25cm2)瓶。本专利技术的用于收集豆状囊尾蚴外泌体的豆状囊尾蚴离体培养方法是：将从感染兔的腹腔中新鲜分离完整的豆状囊尾蚴在无菌条件下用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有进行过去除外泌体处理的培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48小时换液1次。优选地，本专利技术的用于收集豆状囊尾蚴外泌体的豆状囊尾蚴离体培养方法中所用的PBS中加有100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，所述的培养液为其中添加有青霉素、链霉素、两性霉素B、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠及进行过去除外泌体处理的胎牛血清的RPMI1640培养液，其中：胎牛血清含量为10％(v/v)；所述抗生素终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，两性霉素B1.25μg/mL；所述L-谷氨酰胺终浓度为2.5mM；加入碳酸氢钠调整培养液pH为7.2～7.4。优选地，本专利技术的豆状囊尾蚴离体培养方法，其初始培养液的加入量为：6孔板加入量为3ml/孔，或者细胞瓶加入量为8ml/(25cm2)瓶。本专利技术的收集豆状囊尾蚴代谢分泌抗原和外泌体的方法是按前述的方法进行豆状囊尾蚴培养，在第二次换液后，每48h收集虫体培养液一次，经浓缩或者超速离心等方法进一步获得代谢分泌抗原或外泌体。本专利技术的优点在于:(1)提供了一种用于豆状囊尾蚴的离体培养方法，有效解决了豆状囊尾蚴离体长时间存活的问题；(2)可以便捷地获得充足的研究材料，如豆状囊尾蚴代谢分泌抗原和外泌体；(3)虫体体外存活时间长，可满足药物筛选及药理评价的筛选周期，同时可直接观察虫体-药物作用；(4)离体培养不依赖于宿主，实现了在可控、直观及已知条件下进行豆状囊尾蚴代谢抗原、免疫效应和药物筛选等研究；(5)简易的培养液配方，实验背景易于控制；(6)指标建立合理，体外培养严格规定仅保持囊尾蚴幼虫存活状态，不涉及虫体生长发育及生殖概念，如幼虫体外生长为成虫；可对幼虫阶段具体实验做出较正确的评估。附图说明图1为本专利技术所述豆状囊尾蚴体外培养的光镜典型形态观察图。其中×40观察o：培养前虫体；a：RPMI-1640+6％兔胆汁培养组；b：PBS培养组；c：RPMI-1640培养组；d：完本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.囊尾蚴体外培养方法，其特征在于从宿主动物体内分离完整的囊尾蚴，在无菌条件下用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。

【技术特征摘要】
1.囊尾蚴体外培养方法，其特征在于从宿主动物体内分离完整的囊尾蚴，在无菌条件下用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。2.一种豆状囊尾蚴离体培养方法，其特征在于将从感染兔的腹腔中新鲜分离完整的豆状囊尾蚴在无菌条件下用其中加入至少一种抗生素的PBS清洗干净，然后转入其内加有培养液的培养容器内，培养容器置于二氧化碳细胞培养箱内，在温度37℃、CO2浓度5％、相对湿度70％条件下进行培养，虫体开始培养后的第6h及第12h各换液1次，每次换液时尽量除去陈旧培养液，加入新鲜的完全培养液8ml/瓶/次，以后每48h换液1次。3.根据权利要求2所述的豆状囊尾蚴离体培养方法，其特征在于所用的PBS中加有100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素，所述的培养液为其中添加有胎牛血清、青霉素、链霉素、两性霉素B、L-谷氨酰胺和碳酸氢钠的RPMI1640培养液，其中：胎牛血清含量为10％(v/v)；所述抗生素终浓度为青霉素100U/ml，链霉素100μg/ml，两性霉素B1.25μg/mL；所述L-谷氨酰胺终浓度为2.5mM；加入碳酸氢钠调整培养液pH为7.2～7.4。4.根据权利要求3所述的豆状囊尾蚴离体培养方法，其特征在于初始培养液的加入量为：6孔板加入量为3ml/孔，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张少华，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：甘肃,62