三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线。本发明专利技术提供了可以同时检测三种真菌毒素的免疫层析试纸条，达到简单、快速、灵敏度高的现场检测的需求，为基层AFB1、T‑2、DON三种真菌毒素快速检测和大量样品的筛查提供方法。

Colloidal gold immunochromatographic assay paper and preparation method of triple mycotoxin

The invention discloses a triple mycotoxin colloidal gold immunochromatographic test paper, which comprises a sample pad, a label pad, a basement membrane and a water absorbent pad connected sequentially according to the flow direction of the sample; the label pad comprises a first gold pad and a second gold pad, the first gold pad contains at least a first antibody labeled with nanogold; the second gold pad contains at least a second antibody labeled with nanogold; The first gold pad or the second gold pad contains a third antibody labeled with gold nanoparticles, and a control line, a first detection line, a second detection line and a third detection line are arranged on the basement membrane in turn along the opposite direction of the sample flow. The invention provides an immunochromatographic test strip capable of simultaneously detecting three mycotoxins to meet the needs of simple, fast and high sensitivity field detection, and provides a method for rapid detection of three mycotoxins at the grass-roots level, such as AFB1, T_2 and DON, and screening a large number of samples.

【技术实现步骤摘要】
三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法
本专利技术涉及一种免疫检测试纸条及制备方法，特别涉及一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸及制备方法。
技术介绍
真菌毒素(Mycotoxins)是真菌在生长过程中产生的低分子量的次级代谢产物，广泛存在于谷物和饲料中，严重影响人和动物的健康。真菌毒素主要损伤动物的免疫器官、中枢神经、肝、肾和生殖器官等内脏组织。另外，有些真菌毒素具有很强的致畸、致癌、致突变作用。目前己知的真菌毒素有300多种，对人和动物危害相对较严重的真菌毒素有黄曲霉毒素B1(AFB1)、呕吐毒素(DON)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、烟曲霉毒素(FUM)、赭曲霉毒素A(OTA)以及T-2毒素等。黄曲霉毒素是迄今为止己知的毒性最强的有毒物质之一，在几种黄曲霉毒素中，毒性最强的是黄曲霉毒素B1(AFB1)，其毒性高于氰化钾10倍，属于特剧毒物质范畴。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)主要的毒性机理是通过与S60核糖体结合或抑制肽基转移酶的活性抑制真核细胞的蛋白合成，具有急性毒性，会导致动物体重减轻，免疫力低下，还具有“三致”作用，诱发肝脏癌变等危害。T-2毒素也属于镰刀菌产生的单端孢霉烯族毒素，主要Fusariumsporotrichioides,Fusariumpoae,andFusariumacuminatum等镰刀菌分泌产生，T-2急性毒性主要症状：呕吐、腹泻、低剂量的长期暴露引起炎症反应、免疫系统紊乱、动物拒食、生长阻止、淋巴组织和肠道黏膜损伤，动物在采食这些饲料时可能会摄入多种真菌毒素，多种真菌毒素对动物健康和生产性能产生的副作用比单一毒素的危害大。近年来，真菌毒素多重检测方法发展迅速，如利用稀土离子Eu3+和Sm3+作为示踪剂建立的时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)，可实现对呕吐毒素和玉米赤霉烯酮的同时检测；采用液相色谱质谱联用法(LC-MS/MS)同时检测谷物中多种真菌毒素以及利用超高液相色谱(UPLC)同时检测咖啡豆中真菌毒素的混合污染等。这些方法特异性好，灵敏度较高，但操作复杂，耗时较长，无法满足大量样本的快速筛查。胶体金免疫层析技术由于具备快速、简便、低成本的特点，近年来发展迅速，主要包括竞争法和双抗体夹心法。真菌毒素属于小分子，多采用竞争反应模式，待检样本阴性时，检测线显色，待检样本阳性时，检测线不显色。由于胶体金颗粒制备简单且标记过程温和，以免疫层析为基础的多重检测模式目前已成为食品安全检测领域的研究热点。
技术实现思路
专利技术目的：本专利技术提供了一种三联胶体金免疫层析检测法，在满足方便、快捷和低成本的同时，实现对谷物和饲料中上述三种真菌毒素的同时快速检测。技术方案：本专利技术所述的一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线；所述第一检测线包含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；所述第二检测线包含有与第二抗体特异性结合的第二抗原；所述第三检测线包含有与第三抗体特异性结合的第三抗原。优选地，所述第一抗体为AFB1单克隆抗体；所述第二抗体为T-2单克隆抗体，所述第三抗体为DON单克隆抗体。优选地，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL-1。优选地，所述第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为2-3mm；所述第三检测线与控制线之间的间隔为4-5mm。优选地，所述纳米金的粒径为20-40nm。上述三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：(1)制备标记垫：(1a)制备胶体纳米金溶液：将氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器，加热至沸腾时，加入柠檬酸钠溶液，持续加热至溶液颜色均匀稳定，并继续煮沸5-10min，室温自然冷却，制备纳米金粒径在20-40nm；(1b)在胶体纳米金溶液中加入抗体，制备纳米金标记的第一抗体溶液、纳米金标记的第二抗体溶液以及纳米金标记的第三抗体溶液；(1c)将步骤(1b)中标记好的抗体溶液滴加至金标垫上烘干，制备第一金垫和第二金垫；(2)制备基膜：用第一抗原-BSA溶液制备第一检测线、第二抗原-BSA溶液制备第二检测线、第三抗原-BSA制备第三检测线、羊抗鼠IgG溶液制备控制线；(3)将步骤(1)制备的第一金垫和第二金垫贴合组成标记垫，随后，依次将吸水垫、基膜、标记垫和样品垫粘合在底板上，切成条状，得到三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸。优选地，步骤(1b)中，所述第一抗体溶液中第一抗体的浓度为8-10μg·mL-1、所述第二抗体溶液的浓度为8-10μg·mL-1，所述第三抗体溶液的浓度为6-10μg·mL-1。优选地，步骤(2)中，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-0.1.2mg·mL-1。优选地，步骤(2)中，所述羊抗鼠IgG溶液的浓度为0.25-0.8mg·mL-1。优选地，步骤(2)中，所述第三检测线与控制线间隔为4-5mm。有益效果：(1)本专利技术提供了可以同时检测三种真菌毒素的免疫层析试纸条，达到简单、快速、灵敏度高的现场检测的需求，为基层AFB1、T-2、DON三种真菌毒素快速检测和大量样品的筛查提供方法；(2)本专利技术中标记垫包括第一金垫与第二金垫，检测灵敏度增加，同时，多层金垫在增加反应的同时，减缓流速，增加反应时间，提高试纸条的灵敏度。附图说明图1为本专利技术免疫层析试纸的结构示意图；图2为本专利技术胶体金溶液紫外-可见光光谱扫描图；图3为本专利技术胶体金透射电子显微镜成像图；图4为本专利技术免疫层析纸条的灵敏度测试结果图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作出进一步说明。本专利技术的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸结构如下：如图1所示，在底板1上按照样品流动方向依次连接样品垫2、标记垫3、由硝酸纤维素膜制备的基膜4以及吸水垫5；标记垫3由第一金垫31与第二金垫32组成，本专利技术的标记垫上共负载有三种利用纳米金标记的抗体，第一金垫含有纳米金标记的第一抗体，第二金垫含有纳米金标记的第二抗体，纳米金标记的第三抗体可位于第一金垫或第二金垫上，本实施例中的第一抗体为AFB1单克隆抗体；第二抗体为T-2单克隆抗体，第三抗体为DON单克隆抗体，第三抗体位于第二金标垫上。基膜4上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线41、第一检测线42、第二检测线43以及第三检测线44，第一检测线上含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；第二检测线含有与第二抗体特异性结合的第二抗原，第三检测线含有与第三抗体特异性结合的第三抗原，检测线上为羊抗鼠IgG溶液，第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为3mm，第本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线；所述第一检测线包含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；所述第二检测线包含有与第二抗体特异性结合的第二抗原；所述第三检测线包含有与第三抗体特异性结合的第三抗原。

【技术特征摘要】
1.一种三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，包括按照样品流动方向依次连接的样品垫、标记垫、基膜以及吸水垫；所述标记垫包括第一金垫与第二金垫，所述第一金垫至少包含有纳米金标记的第一抗体；所述第二金垫至少包含纳米金标记的第二抗体；所述第一金垫或第二金垫上包含有纳米金标记的第三抗体；所述基膜上沿着与样品流动的相反方向依次设置有控制线、第一检测线、第二检测线以及第三检测线；所述第一检测线包含有与第一抗体特异性结合的第一抗原；所述第二检测线包含有与第二抗体特异性结合的第二抗原；所述第三检测线包含有与第三抗体特异性结合的第三抗原。2.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一抗体为AFB1单克隆抗体；所述第二抗体为T-2单克隆抗体，所述第三抗体为DON单克隆抗体。3.根据权利要求2所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线划线的抗原为AFB1-BSA，浓度为0.2-0.6mg·mL-1；所述第二检测线划线的抗原为T-2-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL-1；所述第三检测线划线的抗原为DON-BSA，浓度为0.4-1.2mg·mL-1。4.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线、第二检测线及第三检测线之间间隔为2-3mm；所述第三检测线与控制线之间的间隔为4-5mm。5.根据权利要求1所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述纳米金的粒径为20-40nm。6.一种如权利要求1-5任一所述的三联真菌毒素胶体金免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备标记垫：(1a)制备胶体纳米金溶液：将氯金酸溶液置于磁力搅拌加热器，加热至沸腾时，加入柠檬...

【专利技术属性】
技术研发人员：张海彬，鲁希，吴文达，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32