检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测黄曲霉毒素M1的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品、黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测黄曲霉毒素M1的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明专利技术检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。

Time-resolved fluorescence immunoassay kit for detection of aflatoxin M1

【技术实现步骤摘要】
检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫试剂盒
本专利技术属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
技术介绍
黄曲霉毒素（Aflatoxins，AFT）是真菌的次级代谢产物，主要是由黄曲霉（A.flavus）、寄生曲霉（A.parasiticus）和集蜂曲霉（A.nonius）一些菌株产生的；黄曲霉的产毒能力由于菌株的不同而差异甚大；寄生曲霉的所有菌株都能产生黄曲霉毒素。黄曲霉毒素是一种毒性很强的肝毒素，可引起肝脏的急性或慢性损害，它与乙肝病毒被认为是肝癌的最主要的两大诱因；除损害机体的肝脏以外，黄曲霉毒素对肾脏等其他多种组织器官也能造成严重损害，更为严重的是黄曲霉毒素已被证实具有致癌、致畸、致细胞突变的“三致”作用。黄曲霉毒素广泛存在于花生、玉米、麦类、稻谷等谷物农产品中，在通心粉、调味品、牛奶和食用油等食品中也经常发现，严重危害人、畜、禽类健康。黄曲霉毒素B1被公认为是目前致癌力最强的天然物质，1993年黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为Ⅰ类致癌物。自从1961年发现黄曲霉毒素以来，黄曲霉毒素的种类越来越多。目前已分离鉴定出十二种，分别是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2、M1、M2、B2a、G2a、GM1、R0和毒醇；从化学结构上看，各种黄曲霉毒素的结构非常相似，都含有一个双呋喃环和氧杂萘邻酮（香豆素），前者为基本毒性结构，后者可能与致癌有关。黄曲霉毒素的毒性比氰化物和砒霜大很多倍。目前已查明，黄曲霉毒素对人和很多种动物都表现出剧烈的毒性，而且具有明显的致癌能力；其中黄曲霉毒素B1毒性最大，致癌能力最强，G1、M1其次，B2、G2和M2较弱。黄曲霉毒素B1除致癌外，还能引起突变和导致畸形。黄曲霉毒素B1的LD50为0.249mg/kg,小于1mg/kg，属特剧毒物质，其毒性为氰化钾的10倍、为砒霜的68倍。人们发现，黄曲霉毒素B1是目前所有已知致癌物中致癌力最强的一种。我国规定鲜乳中黄曲霉毒素M1含量不能超过0.5μg/kg，而婴幼儿食品及乳粉中的黄曲霉毒素不得检出。关于黄曲霉毒素的检测方法已经出现了许多的化学检测方法，如气相色谱法（GC）、高效液相色谱法（HPLC）、薄层层析法、分光光度法、液质联用仪（LC-MS）、气质联用仪（GC-MS）等。化学检测方法存在测试成本高、分析时间长、检测所需样品量大（通常>500mL）及前处理步骤繁琐等不足，无法在较大范围内系统、全面、快速分析黄曲霉毒素的含量。而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对黄曲霉毒素M1检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种牛奶中黄曲霉毒素M1残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。本专利技术的目的之二在于提供一种快速简便地检测牛奶中黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测农作物中黄曲霉毒素M1残留量。本专利技术目的之一是这样实现的：检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、黄曲霉毒素M1标准品溶液、抗黄曲霉毒素M1的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。本专利技术目的之二是这样实现的：检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：(1)免疫原的制备：将半抗原黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（黄曲霉毒素M1-BSA）；(2)包被原的制备：将半抗原黄曲霉毒素M1与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（黄曲霉毒素M1-OVA）；(3)单克隆抗体的制备：a.用步骤(1)的免疫原（黄曲霉毒素M1-BSA）免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；b.以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体IgG；c.用步骤(2)的包被原包被96孔包被板；(4)样品的前处理及检测：取包被有包被原（黄曲霉毒素M1-OVA）的多孔包被板，加入50µL的黄曲霉毒素M1到各自的微孔中，加50µL以缓冲液稀释的抗黄曲霉毒素M1抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100µLEu3+-兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M1含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作为固相载体。本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测黄曲霉毒素M1。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面：第一，特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体IgG。第二，Eu3+标记抗体的制备。本专利技术测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有黄曲霉毒素M1-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗黄曲霉毒素M1抗体，振荡反应，游离的黄曲霉毒素M1与微孔板上的黄曲霉毒素M1-OVA竞争抗黄曲霉毒素M1抗体，洗涤液洗涤，没有连接的黄曲霉毒素M1抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗体,进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外灯的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中黄曲霉毒素M1的量。本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。具体实施方式实施例1、免疫原与包被原制备本专利技术免疫原（黄曲霉毒素M1-BSA）的合成：准确称取黄曲霉毒素M1324mg溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3小时，调节反应液pH10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入BSA溶液中（320mgBSA溶解于5mL生理盐水），再加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）23mg，N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）45.4mg，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液（PBS）透析3天，每6小时更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用；包被原（黄曲霉毒素M1-OVA）的合成：在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶联物黄曲霉毒素M1-OVA，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。2、单克隆抗体制备2.1动物免疫用步骤1制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100µg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/LpH7.4PBS溶解免疫原（黄曲霉毒素M1-BSA），再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，劲背部皮下分2～3点注射；加强免疫，用0.01本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，黄曲霉毒素M1标准品，黄曲霉毒素M1的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。

【技术特征摘要】
1.一种检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，黄曲霉毒素M1标准品，黄曲霉毒素M1的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。2.一种根据权利要求1所述检测黄曲霉毒素M1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：(1)将黄曲霉毒素M1与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；(2)将黄曲霉毒素M1与卵血清蛋白偶联，得到包被原；(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗黄曲霉毒素M1的单克隆抗体(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的黄曲霉毒素M...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜道林，薛永来，洪霞，
申请(专利权)人：江苏维赛科技生物发展有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32