本发明专利技术提供了一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,属于免疫学检测领域。本发明专利技术的试剂盒由包被有噻苯咪唑‑载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板、噻苯咪唑标准品、噻苯咪唑‑过氧化物酶标记抗体工作液、发光底物液、浓缩样品稀释液、浓缩洗涤液组成。所述噻苯咪唑‑载体蛋白偶联物是将噻苯咪唑与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到,浓缩洗涤液含有0.05%吐温‑20。与传统的酶联免疫吸附分析法比较,本发明专利技术的试剂盒具有更高的灵敏度,且检测时间短、费用低,可用于苹果样品中噻苯咪唑的残留量检测。
A Chemiluminescence Immunoassay Kit for the Detection of Thiabendazole
【技术实现步骤摘要】
一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒
本专利技术涉及一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,用于检测动物源性食品中如鸡蛋中的噻苯咪唑含量或残留量。属于免疫学检测领域。
技术介绍
噻苯咪唑是目前经常使用的防腐保鲜剂,常用于采收前或采收后的果蔬,经喷雾或浸蘸后的果蔬,不但可以延长贮存时间,还可保鲜、保色。这些食品添加剂具有一定的生物毒性效应,残留量超标将不可避免对人体健康产生影响。我国对这些杀菌剂有明确的残留限量要求团,国家质检总局发布公告,禁止对轻基苯甲酸丙醋等33种产品作为食品添加剂生产、销售和使用,省质监局已停止受理其生产许可申请闭,其中包含噻苯咪唑。目前,国内外报道的果蔬残留防腐剂的检测方法主要涉及有分光光度法、胶束电动色谱法困、高相液相色谱法、液相色谱串联质谱法、气相色谱串联质谱法等,在各种检测方法的建立,样品前处理是不可缺少的前提条件,尤其是针对痕量分析时,样品前处理是影响分析结果的关键环节,常引起样品检测误差,限制检测灵敏度,尽管提取净化方法有索氏提取、振荡提取、液一液分配、柱层析等技术,虽然这些技术不需要昂贵的设备和特殊仪器,但却是整个分析过程中费时费力、易引起误差的环节;且大量有机溶剂的使用,易造成对环境的污染。因此,需要专利技术一种工序少、操作简便检测的新方法。化学发光免疫检测技术是化学发光法和免疫分析法结合的产物,因此同时具有化学发光检测技术的高灵敏性和免疫分析技术的高特异性。本专利技术通过特有的免疫动物制备具有高亲和力、高特异性的噻苯咪唑抗体,并采用酶标记抗体,建立一种可以检测噻苯咪唑的化学发光免疫试剂盒,将为苹果产品中噻苯咪唑药物留检测提供新方法,对保证畜产品安全提供重要的理论和实践依据,维护畜牧业健康发展具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题,本专利技术主要是利用抗原与抗体的特异性免疫反应的基本原理来实现的。化学发光免疫分析是化学发光法和免疫分析法结合的产物,因此同时具有化学发光法的高灵敏度和免疫分析法的高特异性。在整个反应过程中,样品中噻苯咪唑含量越高,反应体系中发光强度越弱;反之,样品中噻苯咪唑含量越少,发光强度越高。本专利技术是一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于含有以下成份:1、包被有噻苯咪唑-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板;所述噻苯咪唑-载体蛋白偶联物是将噻苯咪唑与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到,所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白;2、噻苯咪唑标准品;3、噻苯咪唑-过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的噻苯咪唑抗体,所述噻苯咪唑抗体为单克隆抗体或多克隆抗体;4、发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液,分为A液和B液保存,在使用前按1:1混合使用;其中A液位发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺,B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液;5、2倍浓缩稀释液;6、20倍浓缩洗涤液;本专利技术中,所述的不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。本专利技术中,所述的噻苯咪唑标准品,由一系列不同浓度的噻苯咪唑标准品组成,浓度为0.02~5.12ng/mL的浓度区间。本专利技术中,所述的噻苯咪唑-过氧化物酶标记抗体为用过氧化物酶标记的噻苯咪唑抗体,如辣根过氧化物酶(HRP)标记的噻苯咪唑抗体。本专利技术中,所述的发光底物液为商品化的任一种以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液。本专利技术中,所述所述2倍浓缩稀释液,其成分为0.01mol/L,pH7.4的磷酸缓冲液、甘氨酸-HCl缓冲液或Tris-HCl缓冲液,使用前请按1:1稀释(1份浓缩样品稀释液+1份去离子水)。本专利技术中,所述20倍浓缩洗涤液,其包含0.05%吐温-20,0.01mol/L的PBST,pH值范围7.0-7.5之间,使用前请按1:19稀释(1份浓缩稀释液+19份去离子水)。本专利技术的噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒应用于噻苯咪唑的检测时,检测步骤为:(1)预处理待测样品,即将待测试的样品处理为液体样品,或者用有机溶剂提取待测样品,氮气吹干并将其复溶于样品稀释液工作液中;(2)将所需试剂从冷藏环境中取出,置于室温(20~25℃)平衡30min以上,注意每种液体试剂使用前均须摇匀;(3)取包被噻苯咪唑抗原的酶标板,加标准品/待测样品50µL/孔到对应的微孔中,标准品和样品每个浓度做两个平行实验。(4)加入噻苯咪唑抗体工作液,50µL/孔,轻轻振荡混匀,用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应45min;(5)小心揭开盖板膜,将孔内液体甩干,用洗涤工作液250µL/孔,充分洗涤4~5次,每次间隔10s,用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破);(6)加入发光底物液混合液(A液与B液在使用前按1:1混合)100µL/孔,轻轻振荡混匀,混合好后在化学发光检测仪内检测发光强度(RLU)。(7)检测结果的计算:用所获得的标准溶液和试样溶液发光值与空白溶液的比值进行计算。见下式:相对发光强度=RLU/RULmax式中:RLU=标准(或样品)溶液的发光强度值;RLUmax=空白(浓度为0的标准溶液)的发光强度值。将计算的相对发光强度值对应噻苯咪唑(µg/L)的自然对数作半对数坐标系统曲线图。各待测样品的噻苯咪唑浓度根据其RLU值在标准曲线上查出,或通过标准曲线相应的方程计算得出。如样品处理中有稀释,应根据标准曲线所得出的样品浓度要再乘以其稀释倍数。即为样本中噻苯咪唑的实际浓度。本专利技术的试剂盒可用于苹果样品中噻苯咪唑的残留量检测。与现有的其它检测噻苯咪唑残留量的实验方法比较,本专利技术的试剂盒有以下优点:(1)采用化学发光免疫法的本专利技术试剂盒,比色谱方法(高效液相、液质联用、气质联用)、毛细管电泳方法更为快速简便,所需仪器更为简单,检测成本更为低廉,同时具有高通量的特点。(2)采用化学发光免疫法的本专利技术试剂盒,比ELISA方法更为灵敏,可以检测出更低浓度和含量的噻苯咪唑残留,同时线性范围更宽。(3)采用化学发光免疫法的本专利技术试剂盒,减少了二抗的使用环节,从而缩短了检测时间;不透明白色酶标板增加了化学发光检测仪灵敏度。另外,用噻苯咪唑-载体蛋白偶联物而非噻苯咪唑抗体来包被不透明白色酶标板,减少了噻苯咪唑抗体的不稳定性,保证了试剂盒的长期有效性。具体实施方式以下通过具体的实施例对本专利技术作进一步描述。这些实施例仅用于说明本专利技术,而不用来限制本专利技术的范围。实施例11、试剂盒各组分的制备(1)噻苯咪唑半抗原的制备:将噻苯咪唑酸化,在4℃无光低温环境中与亚硝酸钠作用,生成含重氮基正离子的中间体。重氮化的噻苯咪唑作为半抗原,用于后面合成免疫抗原与包被抗原。(2)噻苯咪唑-牛血清白蛋白(BSA)免疫原的制备:将噻苯咪唑与牛血清白蛋白(BSA)采用重氮化法进行偶联得到免疫抗原。噻苯咪唑-卵血清白蛋白(OVA)包被抗原的制备:将噻苯咪唑与卵血清白蛋白(OVA)采用重氮化法进行偶联得到包被抗原。噻苯咪唑-过氧化物酶标记抗体的制备:对6~8周龄的雌性BALB/c小鼠(体重18~20g),大剂量免疫方案为,首次免疫用160µg噻苯咪唑-BSA与等量弗氏完全佐剂混匀,皮下注射。3周后,再用80µg噻苯咪唑-BSA与等量弗氏完全佐本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于试剂盒中的以下成份:(1)包被有噻苯咪唑‑载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板;所述噻苯咪唑‑载体蛋白偶联物是将噻苯咪唑与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到,所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白;(2)噻苯咪唑标准品;(3)噻苯咪唑‑过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的噻苯咪唑抗体,所述噻苯咪唑抗体为单克隆抗体;(4)发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液,分为A液和B液保存,在使用前按1:1混合使用;其中A液为发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺,B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液;(5)2倍浓缩稀释液;(6)20倍浓缩洗涤液。
【技术特征摘要】
1.一种检测噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,其特征在于试剂盒中的以下成份:(1)包被有噻苯咪唑-载体蛋白偶联物的不透明白色酶标板;所述噻苯咪唑-载体蛋白偶联物是将噻苯咪唑与载体蛋白通过混合酸酐法或碳二亚胺法偶联得到,所述载体蛋白为人血清白蛋白、牛血清白蛋白、鸡蛋白蛋白、鼠血清蛋白或兔血清蛋白;(2)噻苯咪唑标准品;(3)噻苯咪唑-过氧化物酶标记抗体:该成分为用过氧化物酶标记的噻苯咪唑抗体,所述噻苯咪唑抗体为单克隆抗体;(4)发光底物液:该发光底物液是以鲁米诺货异鲁米诺为发光剂的化学发光底物液,分为A液和B液保存,在使用前按1:1混合使用;其中A液为发光增强剂加鲁米诺货发光增强剂加异鲁米诺,B液为过氧化氢溶液或尿素过氧化氢溶液;(5)2倍浓缩稀释液;(6)20倍浓缩洗涤液。2.根据权利要求1的噻苯咪唑的化学发光免疫检测试剂盒,其中,所述不透明白色酶标板为96孔的可拆卸或不可拆卸的不透明白色酶标板。3.根据权利要求1的噻苯咪...
【专利技术属性】
技术研发人员:洪霞,袁超,张淑雅,
申请(专利权)人:镇江华维检测技术有限公司,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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