一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种检测孔雀石绿的时间荧光分辨荧光免疫分析试剂盒。所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析检测试剂盒是由多孔包被板、缓冲液、孔雀石绿标准品、孔雀石绿的抗体冻干品、铕标记的羊抗鼠抗体、洗涤液和增强液所组成。所述检测孔雀石绿的时间荧光免疫分析试剂盒的检测方法包括下列步骤：(1)免疫原的制备；(2)包被原的制备；(3)单克隆抗体的制备；(4)样品的前处理及检测。本发明专利技术检测时间短、平均回收率高、样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，检测成本低，同时具有检测特异性强，批内和批间差异小、灵敏度高和操作简单快速，且特别适合于大批量样品的检测等优点。

A time resolved fluoroimmunoassay kit for the determination of malachite green

【技术实现步骤摘要】
一种测定孔雀石绿的时间分辨荧光免疫试剂盒
本专利技术属于生物检测领域，具体的说，涉及一种检测孔雀石绿孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒。
技术介绍
孔雀石绿(MG)是一种三苯甲烷类工业染料，常用于制陶、纺织、皮革、食品颜色剂和细胞化学染色剂等。也可用作驱虫剂、杀虫剂、防腐剂，是药用染料中抗菌效力较强的一类，用于预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。近年来发现孔雀石绿(MG)特别是其代谢产物无色孔雀石绿(LMG)在水产动物体内有明显的蓄积残留现象，而其化学官能团三苯甲烷是一类致癌物质，食用经MG治疗的水产品后，免疫系统和繁殖系统受到较大的影响，具体地说是一种水产品中孔雀石绿快速定性的检测方法。目前已发现可以致癌的化合物约有450余种，孔雀石绿，三苯甲烷类工业染料，是一种重要的化学致癌物，使用被其污染的水体，对人体健康有很大的威胁。测定食品及环境中孔雀石绿及其代谢物常用高效液相色谱法。采用二氧化铅衍生柱进行柱前或柱后氧化，将无色孔雀石绿氧化为孔雀石绿后进行检测"驯；或者利用HPLC一荧光检测法直接检测鱼肉组织中的无色孔雀石绿。虽然这些方法的准确度较高，但仪器昂贵、样品预处理复杂、费时、检测成本高。为了确保动物食品安全，避免孔雀石绿对水生物及人体健康的危害，有必要建立对水产动物中孔雀石绿残留监测的灵敏、快速的分析方法。而时间分辨荧光免疫分析法（TR-FIA）由于其特异性强、灵敏度高、操作简单、廉价，且特别适于大批量样品的检测等优点而越来越被人们所重视和采用。目前还没有针对孔雀石绿孔雀石绿检测的时间荧光免疫分析法的专利和文献报道。
技术实现思路
为解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一种水产品中孔雀石绿残留的检测时间分辨荧光免疫分析试剂盒。本专利技术的目的之二在于提供一种快速简便地检测水产品中孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，用于定量或定性地检测农作物中孔雀石绿残留量。本专利技术目的之一是这样实现的：检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其关键在于由多孔包被板、缓冲液、孔雀石绿标准品溶液、抗孔雀石绿的抗体冻干品、铕标记的兔抗鼠抗体、洗涤液和增强液体所组成。本专利技术目的之二是这样实现的：检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒的检测方法，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理及检测，其关键在于：(1)免疫原的制备：将半抗原孔雀石绿与牛血清白蛋白（BSA）偶联，得到免疫原（孔雀石绿-BSA）；(2)包被原的制备：将半抗原孔雀石绿与卵血清白蛋白（OVA）偶联，得到包被原（孔雀石绿-OVA）；(3)单克隆抗体的制备：a.用步骤(1)的免疫原（孔雀石绿-BSA）免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗孔雀石绿的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；b.以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗孔雀石绿的单克隆抗体IgG；c.用步骤(2)的包被原包被96孔包被板；(4)样品的前处理及检测：取包被有包被原（孔雀石绿-OVA）的多孔包被板，加入50µL的孔雀石绿到各自的微孔中，加50µL以缓冲液稀释的抗孔雀石绿抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗3次，加以缓冲液稀释的100µLEu3+-兔抗鼠抗体，25℃～37℃振荡0.5~1小时，洗涤液洗6次，加200µL增强液振荡5分钟后测量荧光强度cps，根据标准曲线计算样品中的孔雀石绿含量。上述的固相载体是多孔包被板，采用96孔的多孔包被板作为固相载体。本专利技术主要采用时间分辨荧光免疫分析方法来检测孔雀石绿。采用时间分辨荧光免疫分析法的技术主要有两个方面：第一，特异性单克隆抗体制备，用偶联的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗孔雀石绿的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗孔雀石绿的单克隆抗体IgG。第二，Eu3+标记抗体的制备。本专利技术测定方法：测定的基础是标记免疫反应。包被有孔雀石绿-OVA的多孔包被板，加入测试样品到各自的微孔中，再加入抗孔雀石绿抗体，振荡反应，游离的孔雀石绿与微孔板上的孔雀石绿-OVA竞争抗孔雀石绿抗体，洗涤液洗涤，没有连接的孔雀石绿抗体在洗涤步骤中被除去。加入Eu3+-兔抗鼠抗体,进行标记免疫反应，再用洗涤液洗涤，反应后没有连接的Eu3+-兔抗鼠抗体在洗涤步骤中被除去。加增强液振荡后，在紫外灯的激发下发射很强的荧光，用时间分辨荧光仪测定其荧光强度cps，荧光强度与样品中的浓度成反比，对照标准曲线即可确定样品中孔雀石绿的量。本专利技术检测方法不需要昂贵的仪器，样品前处理简单、能现场操作检测，应用广泛，该方法灵敏、准确、快速，操作简便、特异性强，适用于大批样品的快速检测。具体实施方式实施例1、免疫原与包被原制备本专利技术免疫原（孔雀石绿-BSA）的合成：准确称取孔雀石绿324mg溶解在2mLN,N-二甲基甲酰胺中，搅拌下逐滴加入γ-氨基丁酸溶液，搅拌反应3小时，调节反应液pH10左右。离心除掉沉淀物。将上述反应逐滴加入BSA溶液中（320mgBSA溶解于5mL生理盐水），再加入N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）23mg，N,N-二环己基碳二亚胺（DCC）45.4mg，4℃反应过夜，离心除去沉淀，取上清液用磷酸缓冲液（PBS）透析3天，每6小时更换透析液，将所得产物低压冻干，于-20℃保存备用；包被原（孔雀石绿-OVA）的合成：在上述反应中，将BSA换成OVA后，得到反应偶联物孔雀石绿-OVA，该偶联物作为TR-FIA检测时作为包被原使用。2、单克隆抗体制备2.1动物免疫用步骤1制备的免疫原分别免疫6周龄雌性Balb/c小鼠，每只小鼠的免疫剂量为100µg/0.2mL。首次免疫，用无菌0.01mol/LpH7.4PBS溶解免疫原（孔雀石绿-BSA），再与等量弗氏完全佐剂混合，完全乳化，劲背部皮下分2～3点注射；加强免疫，用0.01mol/LpH7.4PBS溶解免疫原与等量弗氏完全佐剂混合，充分乳化，小鼠腹腔注射。每次间隔14～21天，第3次免疫后7～10天开始对免疫小鼠尾静脉采血，收集血清，用ELISA检测小鼠血清效价。末次免疫后间隔4周以上，在细胞融合前3～4天，腹腔注射孔雀石绿-BSA抗原100µg/0.2mL/只，注射后每天注意观察，保证融合前小鼠状态良好。2.2单克隆抗体制备分离免疫小鼠的脾细胞，并进行匀浆制备免疫脾细胞。取1只免疫的Balb/c小鼠，从眼眶放血分离血清作为阴性血清，处死。小鼠用75%酒精浸泡5min，进行整体消毒。将小鼠四肢固定，然后用镊子夹住小鼠下腹部皮肤，剪开一小口，再用镊子撕开皮肤，露出腹膜，换一套镊子和剪刀，在腹部中央腹膜上用剪刀剪开一小口。换一套镊子和剪刀，用剪刀剪开腹膜，露出脾脏，再换一套器械用镊子夹住脾脏，用剪刀将脾脏外膜剪破，然后放入事先灭菌的匀浆器中。加适量基础培养基（RPMI-1640）于匀浆器中，进行研磨，挤压出脾细胞本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，孔雀石绿标准品，孔雀石绿的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，其特征在于：由多孔包被板，缓冲液，孔雀石绿标准品，孔雀石绿的抗体冻干品，铕标记的羊抗鼠抗体，洗涤液和增强液所组成。


2.一种根据权利要求1所述检测孔雀石绿的时间分辨荧光免疫分析试剂盒，包括免疫原、包被原和单克隆抗体的制备以及样品前处理，其特征在于：
(1)将孔雀石绿与牛血清白蛋白偶联，得到免疫原；
(2)将孔雀石绿与卵血清蛋白偶联，得到包被原；
(3)用步骤(1)的免疫原免疫小鼠，通过杂交瘤技术，得到分泌抗孔雀石绿的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
(4)以体内诱生腹水法大量制备抗体，使用ProteinG柱进行纯化，获得抗孔雀石绿的单克隆抗体
(5)用步骤(2)的包被原包被固相载体；
(6)将动物组织先经过酸解提取后，再过MAX柱净化，最后加入衍生试剂和催化剂进行处理，得到待测产物；
(7)将步骤(6)的待检物进行测量荧光强度cps，对照标准曲线计算样品中的孔雀石绿孔雀石绿含...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜霞，洪霞，秦悦，
申请(专利权)人：镇江华维检测技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32