一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法，涉及慢病毒检测技术领域，用于测试病毒含量与核酸残留及可复制慢病毒。该核酸组包括用于检测慢病毒VSV‑G基因的引物对，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。该核酸组可以用于检测样品中的慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。

A nucleic acid group and detection method for lentivirus detection

The invention discloses a nucleic acid group and detection method for detecting lentivirus, which relates to the technical field of lentivirus detection, and is used for testing virus content, nucleic acid residue and replicable lentivirus. The nucleic acid group includes a pair of primers for detecting the lentivirus VSV G gene, which includes the upstream primers shown in SEQ ID NO.1 and the downstream primers shown in SEQ ID NO.2. The nucleic acid group can be used to detect lentiviruses in samples with high specificity and sensitivity.

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法
本专利技术涉及慢病毒检测
，具体而言，涉及一种用于检测慢病毒的核酸组和检测方法。
技术介绍
慢病毒载体(Lentiviralvector)较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达用于基因治疗的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分化的后代细胞中表达特定基因，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳定的基因表达的功能性表达或沉默，为基因治疗、及在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为外源基因的携带者，慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果。对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，使用慢病毒载体，能大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率大大增加，能够比较方便快捷地实现目的基因或目的shRNA的长期、稳定表达。慢病毒表达载体，即通常所说的穿梭载体，包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞，在细胞中进行病毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后，可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后，经过反转录，整合到基因组，从而高水平的表达效应分子。慢病毒包装系统一般都是三质粒或四质粒包装系统。CART细胞需要慢病毒载体将CAR基因转入活化的T细胞。常见的慢病毒检测方法有两种，分别为酶联免疫吸附实验(ELISA)和qPCR检测。其中酶联免疫吸附实验在慢病毒检测中发挥了重要的作用，但是此方法也存在一定的缺陷。酶联免疫吸附实验试剂盒价格较高，并且检测范围窄，灵敏度相对较差。qPCR检测价格低，检测范围宽，灵敏度高；但是没有明确的检测方法和对应的检测引物和探针。鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于检测慢病毒的核酸组，该核酸组可以用于检测慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。本专利技术的另一目的在于提供一种快速检测慢病毒残留及可复制慢病毒的方法，该方法可以有效检测样品中的慢病毒残留及可复制慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。本专利技术是这样实现的：聚合酶链式反应简称PCR(PolymeraseChainReaction)(又称：多聚酶链式反应)PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促合反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火——引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。一方面，本专利技术提供了一种用于检测慢病毒的核酸组，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对，所述引物对包括：SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述核酸组还包括碱基序列如SEQIDNO.3所示的荧光探针。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述荧光探针一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、CY3、TexasRed、JOE或TFAM。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，所述淬灭基团选自TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB、BHQ1或BHQ2。本专利技术根据慢病毒上VSV-G的基因序列，设计出特异性的引物和序列，可以以含有VSV-G序列的质粒作为标准品，不仅可以检测样本中的慢病毒，还可具体检测样本中含有慢病毒基因的拷贝数。本专利技术的专利技术人通过对引物和探针序列的合理优化配置，使其检测结果具有更好的特异性和灵敏度，实现对样品中的慢病毒及其拷贝数的有效检测。另一方面，本专利技术还提供了一种检测慢病毒的方法，其包括：使用如上所述的核酸组对提取自待检样品的DNA待测样品进行PCR扩增。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，在PCR扩增的反应体系中，上游引物浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为240-260pmol/ml，下游引物浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为240-260pmol/ml。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，PCR扩增的反应体系含有如SEQIDNO.3所示的荧光探针，所述荧光探针的浓度为：10-500pmol/ml，优选范围为380-420pmol/ml。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，PCR扩增的反应体系还添加有0-10％的二甲基亚砜；优选的，二甲基亚砜的浓度为：3％。二甲基亚砜加入至反应体系中有助于提高引物对和探针的灵敏度和特异性，避免非特异性扩增对实验的影响。进一步地，在本专利技术的一些实施方案中，PCR扩增的退火温度为55-65℃，优选为59℃。本专利技术的核酸组可以通过实时荧光定量PCR的方法，快速准确的检测样本中慢病毒基因(VSV-G)的拷贝数，判断样本的阴阳性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术实验例中的对不同浓度的阳性标准质粒的荧光扩增曲线结果，图中：从左往右依次是：1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。以下结合实施例对本专利技术的特征和性能作进一步的详细描述。实施例1本实施例提供的用于检测慢病毒的核酸组，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对和荧光探针，其中，荧光探针的5’端有荧光基团FAM，3’端有淬灭基团TAMRA。所述荧光探针碱基序列如SEQIDNO.3所示。所述引物对包括：SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物。引物对和荧光探针的碱基序列如下表1所示。表1采用本实施例的核酸组进行实时荧光定量PCR检测的方法如下：(1)配制实时荧光定量PCR反应体系(以20μl为例)：上游引物和下游引物(浓度为10μM)各0.5μl，荧光探针(浓度为10μM)0.8μl，PremixExTaq(probeqPCR)(2×)反应液10μl，二甲基亚砜0.6μl(体系中的浓度为3％，质量体积比：反应总体系20μl，加入二甲基亚砜的体积为0.6μl)，ROX溶液0.2μl，DNA模板10ng或者标准质粒溶液2μl，加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于检测慢病毒的核酸组，其特征在于，其包括用于检测慢病毒VSV‑G基因的引物对，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的上游引物和SEQ ID NO.2所示的下游引物。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测慢病毒的核酸组，其特征在于，其包括用于检测慢病毒VSV-G基因的引物对，所述引物对包括：SEQIDNO.1所示的上游引物和SEQIDNO.2所示的下游引物。2.根据权利要求1所述的核酸组，其特征在于，所述核酸组还包括碱基序列如SEQIDNO.3所示的荧光探针。3.根据权利要求2所述的核酸组，其特征在于，所述荧光探针一端标记有荧光基团，另一端标记有淬灭基团。4.根据权利要求3所述的核酸组，其特征在于，所述荧光基团选自FAM、HEX、VIC、TET、CY5、CY3、TexasRed、JOE或TFAM。5.根据权利要求4所述的核酸组，其特征在于，所述淬灭基团选自TAMRA、Dabcyl、Eclipse、MGB、BHQ1或BHQ2。6.一种检测慢病毒的方法，其特征在于，其包括：使用权利要求1-5任一项所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙耀光，祁雪，姚连琦，张亮，席在喜，
申请(专利权)人：上海邦耀生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31