一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：S1.诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态；S2.生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备；S3.免疫磁珠富集，免疫磁珠所需体积为10μL~200μL，副溶血性弧菌菌液所需体积为0.5~1mL；S4.PMAxx染色：在步骤S3富集后的样品中加入PMAxx使其终浓度达到10~20μmol/L，染色后进行检测。本发明专利技术提供了一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，首次将免疫磁珠技术、PMAxx染料以及qPCR定量检测技术相结合应用于实际样品免前增菌条件下VBNC状态菌的检测中。通过实验能够证明，该方法对VBNC状态副溶血性弧菌的检测限为1.05CFU/g，该方法不仅灵敏度高且特异性好。

A Rapid Quantitative Method for Detecting Vibrio parahaemolyticus in VBNC

The invention provides a method for rapid and quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus in VBNC state, including the following steps: S1. Inducing Vibrio parahaemolyticus into VBNC state; S2. Preparation of biotinylated polyclonal antibodies and immunomagnetic beads; S3. Immunomagnetic beads enrichment, the required volume of immunomagnetic beads is 10 UL-200 UL, the required volume of Vibrio parahaemolyticus liquid is 0.5-1 mL; S4. PMAxx staining: 3. PMAxx was added to the enriched samples to make the final concentration reach 10-20 micromol/L. The samples were dyed and detected. The invention provides a method for rapid quantitative detection of Vibrio parahaemolyticus in VBNC state. For the first time, the combination of immunomagnetic beads technology, PMAxx dye and qPCR quantitative detection technology is applied to the detection of VBNC state bacteria in real samples without pre-enrichment. Experiments show that the detection limit of this method for Vibrio parahaemolyticus in VBNC state is 1.05 CFU/g. This method has high sensitivity and specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法
本专利技术属于食源致病菌快速定量检测
，更具体地，涉及一种副溶血性弧菌的定量检测，特别是涉及活的不可培养状态的副溶血性弧菌的快速定量检测。
技术介绍
副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus,VP）是广泛分布于近海区域、盐湖及海产品中的革兰氏阴性短杆嗜盐菌，能感染鱼类、对虾、甲壳类等多种水产动物，人畜食用了受该菌污染的海产品后，会出现食物中毒及腹泻等症状，它是一种可引起食源性疾病的病原菌。在一些沿海的城市中，由副溶血性弧菌引起的食物中毒事件比例高达60％。活的非可培养状态（Viablebutnonculturablestate,VBNC）是细菌受到外界不利环境胁迫时，通过调整自身代谢途径进入的一种自我保护的状态。目前，已有大量文献证明，处于VBNC状态的致病菌仍具有致病性，复苏后能够引起人类疾病。海水是一个常年维持在较低温度（约4℃）且营养缺失的载体，副溶血性弧菌在此低温寡营养条件下可进入VBNC态，这一点已被相关研究证实。另外海产品经捕捞后自身可能携带副溶血性弧菌，在加工、运输、储存过程中，由于存在着各种各样的环境胁迫因素，如高温、低温、寡营养、极端pH等，均可能导致其进入VBNC状态。进入VBNC状态的副溶血性弧菌因具有不可培养性，采用传统的平板检测方法无法将其检出，给食品安全带来巨大隐患。对于VBNC状态的致病菌的检测，目前常用叠氮溴化丙锭（PMA）和荧光定量PCR（qPCR）相结合的方法，但是，该方法仍具有一些不足：1、对于污染水平低的样品，现有检测方法很难将其准确检测出，因此需要在检测前进行增菌处理，但在增菌的过程中一些干扰微生物同样会进行繁殖，为检测结果带来较大的影响。2、PMA能够在qPCR反应中抑制死菌的扩增，能够有效地区分出活菌和死菌，但是它并不能够完全排除来自死细胞DNA的PCR产物，从而带来潜在的“假阳性”结果。针对上述污染水平低，检测准确性差以及“假阳性”等问题，我们提出一种新颖的检测方法，将免疫磁珠分离技术（Immunomagneticseparation,IMS）、PMAxx染料和荧光定量PCR三者相结合，应用于VBNC状态致病菌的检测。IMS是一种免疫学分离技术，磁珠表面活化与活性蛋白质偶联形成免疫磁珠，能够与目标致病菌表面的抗原特异性结合，并在磁场的作用下形成IMS-目标菌复合物，从而达到富集分离的效果。对于一些污染程度较低的样本，采用免疫磁珠富集技术能够准确有效地捕获到目标致病菌，从而达到富集的目的。因此，不需要离心、过滤和增菌的过程，就可以从食品基质溶液中富集食源致病细菌，IMS是一种快速、特异、高效、操作简单富集方法。PMA的改良结构PMAxx染料同样可以穿透死菌或者受损菌的细胞膜并与其DNA进行结合，在强光条件下能使DNA构象发生改变，从而抑制了PCR的扩增，并且，PMAxx能更高效的抑制死菌DNA的扩增，从而具有更高的准确性。通过结合qPCR建立一种利用生物代谢活性作为活菌判断标准的检测技术，对活菌（包括VBNC菌）进行定量检测分析，能克服PMA-qPCR方法在原理上的不足，有效检测出活细胞和VBNC细胞，对于膜完整或膜损伤的死细胞不检测，这也符合致病菌检测的根本要求。因此和常用的检测方法相比，将MIS-PMAxx-qPCR三者相结合，不仅可以检测污染水平低的样本，快速高效的富集目标致病菌而避免其他非目标微生物的干扰，而且能够成功的应用于VBNC状态致病菌的检测，有效地减少了“假阳性”结果的出现，提高了检测的准确性。
技术实现思路
本专利技术针对于现有技术的不足，提供一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法。本专利技术首先采用免疫磁珠分离技术进行副溶血性弧菌富集处理，排除海产品中其他食品基质对检测的干扰；其次，结合新型PMAxx染料，最后通过结合qPCR进行检测，建立了一个快速、便捷、高效的海产品VBNC态VP检测新技术。本专利技术采用以下技术方案实现上述技术目的：一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，包括如下步骤：S1.在-20℃条件下诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态；S2：生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备：将灭活（0.4%甲醛、37℃处理24h）得到的副溶血性弧菌抗原注射入新西兰大白兔体内进行免疫反应得到兔多抗血清，然后经ProteinG/A亲和纯化至效价大于1:50000，最后标记生物素得到生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体；将链霉亲和素磁珠用无菌PBST溶液洗涤2~3次后，再加入上述生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体，孵育制备免疫磁珠；S3.免疫磁珠富集：将步骤S2中经过处理的免疫磁珠与步骤S1中进入VBNC状态的副溶血性弧菌菌液进行混合，得到富集液，其中，免疫磁珠的浓度为0.5~1mg/mL，副溶血性弧菌菌液的浓度为104~106CFU/mL；免疫磁珠的体积为10μL~200μL，副溶血性弧菌菌液的体积为0.5~1mL；S4.PMAxx染色：在步骤S3得到的富集液中加入PMAxx使其终浓度达到10~20μmol/L，染色后进行检测。作为一种优选，PMAxx的浓度为0.5~1mg/mL。作为一种优选，步骤S4经过染色后，将染色后的混合溶液进行总DNA提取，然后采用荧光定量PCR进行检测。作为一种优选，步骤S2中，PBST制备方法为100mL的0.01MPBS加入50µL吐温20。作为一种优选，步骤S2中，链霉亲和素磁珠的量均为20-30µL，加入的生物素化抗体为200-400µL，孵育时间为20-30min；孵育条件为20-30℃。作为一种优选，步骤S3中，免疫磁珠富集过程中，磁珠分离时间为0-5min，磁珠孵育时间为0-90min。作为一种优选，步骤S3中，用免疫磁珠捕获VBNC状态的副溶血性弧菌，捕获率计算方法为：CE（%）=（1-B/A）*100%，其中A是样品中总菌数，单位为CFU/mL；B是未连接到免疫磁珠的致病菌数量，存在于上清液中。作为一种优选，荧光定量PCR检测反应体系包括：总体积为25μL含有1μL的10μM的每种引物F/R和0.5μL的10μMProbe，12.5μLAceQqPCRProbeMasterMix和5μLDNA模板，5μL无菌水，振荡混匀。作为一种优选，步骤S4中，荧光定量PCR检测程序为：在95℃热启动10min，然后进行45个循环的95℃热解离15s和50℃-60℃下退火延伸1min-3min。本专利技术提供了一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，首次将免疫磁珠技术、PMAxx染料以及qPCR定量检测技术相结合应用于实际样品免前增菌增菌条件下VBNC状态菌的检测中。通过实验能够证明，该方法对VBNC状态副溶血性弧菌的检测线为1.05CFU/g，该方法不仅灵敏度高且特异性好。与现有技术相比，本专利技术具备以下优点及有益效果：（1）免前增菌条件下对实际样品实现VBNC状态副溶血性弧菌定量检测，大大节约检测时间；（2）本专利技术将链霉亲和素和生物素相结合形成的免疫磁珠创造性地应用于VBNC状态菌的富集。（3）本专利技术创造性地利用免疫磁珠结合PMAxx特异识别VBNC状态副溶血性弧菌，检出率和特异性水平提高。（4）本专利技术MIS-PMAxx-qPCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.在‑20℃条件下诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态；S2：生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备：将灭活得到的副溶血性弧菌抗原注射入新西兰大白兔体内进行免疫反应得到兔多抗血清，然后经ProteinG/A亲和纯化至效价大于1:50000，最后标记生物素得到生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体；将链霉亲和素磁珠用无菌PBST溶液洗涤2~3次后，再加入上述生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体，孵育制备免疫磁珠；S3.免疫磁珠富集：将步骤S2中经过处理的免疫磁珠与步骤S1中进入VBNC状态的副溶血性弧菌菌液进行混合，得到富集液，其中，免疫磁珠的浓度为0.5~1 mg/mL，副溶血性弧菌菌液的浓度为10

【技术特征摘要】
1.一种快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.在-20℃条件下诱导副溶血性弧菌进入VBNC状态；S2：生物素化多克隆抗体和免疫磁珠的制备：将灭活得到的副溶血性弧菌抗原注射入新西兰大白兔体内进行免疫反应得到兔多抗血清，然后经ProteinG/A亲和纯化至效价大于1:50000，最后标记生物素得到生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体；将链霉亲和素磁珠用无菌PBST溶液洗涤2~3次后，再加入上述生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体，孵育制备免疫磁珠；S3.免疫磁珠富集：将步骤S2中经过处理的免疫磁珠与步骤S1中进入VBNC状态的副溶血性弧菌菌液进行混合，得到富集液，其中，免疫磁珠的浓度为0.5~1mg/mL，副溶血性弧菌菌液的浓度为104~106CFU/mL；免疫磁珠的体积为10μL~200μL，副溶血性弧菌菌液的体积为0.5~1mL；S4.PMAxx染色：在步骤S3得到的富集液中加入PMAxx使其终浓度达到10~20μmol/L，染色后进行检测。2.根据权利要求1所述快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，其特征在于，步骤S2中，PBST制备方法为100mL的0.01MPBS加入50µL吐温20。3.根据权利要求1所述快速定量检测VBNC状态副溶血性弧菌的方法，其特征在于，步骤S2中，链霉亲和素磁珠的量为20~30µL，加入的生物素化的副溶血性弧菌多克隆抗体为200~400µL，孵育时间为20~30mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，曹潇，吕新瑞，赵力超，张竟丰，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44