The present invention relates to a quantitative detection method for drug-resistant genes in Taihu Lake water and sediment, including water and sediment sample collection, total genomic DNA extraction, preparation of target DNA standard products and fluorescence quantitative PCR detection. The drug-resistant genes are sul2 and tetO in sulfonamide-resistant bacteria and tetracycline-resistant bacteria. The invention absolutely quantitatively detects the resistance genes of sulfonamides and tetracyclines antibiotics in Taihu Lake water and sediments by fluorescence quantitative PCR technology, which can help to understand the content level and spatial and temporal distribution characteristics of the resistance genes of tetracyclines and sulfonamides in natural water and sediments such as lakes.
【技术实现步骤摘要】
太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法
本专利技术属于生物
,具体涉及太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法。
技术介绍
抗生素是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物,能够干扰或抑制病原体的生长和存活。常见的抗生素分为四环素类、磺胺类、氨基糖苷类、β-内酰胺类、喹诺酮类、大环内酯类、氯霉素类和多肽类。抗生素作为预防和治疗细菌感染的药物不但广泛应用于临床医疗事业,同时作为饲料添加剂和生长促进剂在水产和畜牧养殖方面也大量使用。大量研究表明,用于医疗事业和畜牧养殖业的抗生素被使用后,仍有高达75%的抗生素未被利用或以活性代谢物的形态被排除生物体外,通过各种途径进入环境,继而所产生的抗生素选择压力,驱动了细菌的变异和水平基因转移,导致了抗生素耐药性的产生和发展。同时,在畜牧养殖业中以低剂量的抗生素来促进禽畜快速生长的养殖方式同时也促进了耐药病菌的生长。作为新兴环境污染物,耐药基因因其分布广、高含量以及潜在的多耐药基因重组特性,受到广泛关注。目前抗性基因在污水处理厂、水产养殖环境、畜牧养殖环境等抗生素含量高的地区都有大量 ...
【技术保护点】
1.一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,包括采集水体和沉积物样本、样本总DNA提取、目标DNA标准品制备及荧光定量PCR检测,其特征在于,所述耐药基因为磺胺类耐药菌中抗性基因sul2和四环素类耐药菌中抗性基因tetO;所述荧光定量PCR反应体系为:
【技术特征摘要】
1.一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,包括采集水体和沉积物样本、样本总DNA提取、目标DNA标准品制备及荧光定量PCR检测,其特征在于,所述耐药基因为磺胺类耐药菌中抗性基因sul2和四环素类耐药菌中抗性基因tetO;所述荧光定量PCR反应体系为:PremixExTaqⅡ10μL;浓度为10μM的上游引物0.3μL;浓度为10μM的下游引物0.3μL;ROXReferenceDyeⅡ0.4μL;ddH2O7μL;反应程序为:预变性:95℃30s;变性:95℃30s,退火:62℃(sul2)/55℃(tetO)30s,延伸:72℃,30s,40个循环。2.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,其特征在于,所述水体和沉积物样本采集方法为:水样采用高压灭菌的聚乙烯瓶采集;沉积物和污泥采用高压灭菌的采样器采集。3.根据权利要求2所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,其特征在于,所述水样取水面以下10cm处水样。4.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,其特征在于,水体和沉积物样本采集后,水样先过5μm滤膜,再过0.22μm滤膜,在4-10℃暗冷处保存;固体样本在-20℃以下保存。5.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,其特征在于,采集的水体样本过膜后,用高压灭菌的剪刀将滤膜剪碎,采用DNA提取试剂盒提取和纯化样本总DNA;固体样本冷冻干燥并研磨后采用试剂盒提取和纯化样本总DNA。6.根据权利要求1所述的一种太湖水体与沉积物中耐药基因的定量检测方法,其特征在于,目标DNA标准品制备过程包括:(1)通过PCR反应扩增出耐药基因的DNA片段;(2)切胶回...
【专利技术属性】
技术研发人员:薛校风,邢鹏,周丽君,
申请(专利权)人:南京师范大学,中国科学院南京地理与湖泊研究所,
类型:发明
国别省市:江苏,32
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