一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。RUNX2是成骨分化过程中关键的调控因子，能够调控众多基因的转录，RUNX2缺失会导致成骨细胞的分化完全被抑制。本发明专利技术发现，川白芷素可显著提高脂肪间充质干细胞成骨分化调控因子RUNX2的表达水平，为有效的RUNX2表达激活剂；将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。

An Osteogenic Inducer and Its Application in Osteogenic Differentiation of Adipose Mesenchymal Stem Cells

The invention discloses an osteogenic inducer and its application in osteogenic differentiation of adipose mesenchymal stem cells. RUNX2 is a key regulator in the process of osteogenic differentiation. It can regulate the transcription of many genes. The absence of RUNX2 can lead to the complete inhibition of osteoblast differentiation. The invention discovers that chuanbaizhi can significantly increase the expression level of osteogenic differentiation regulator RUNX2 of adipose-derived mesenchymal stem cells, and is an effective RUNX2 expression activator; when chuanbaizhi is applied to adipose-derived mesenchymal stem cells, alizarin red staining results show that chuanbaizhi can significantly increase the degree of calcified nodules of cells, indicating that chuanbaizhi can significantly induce the osteogenic differentiation of ADSCs. Effect.

【技术实现步骤摘要】
一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用
本专利技术属于生物领域，涉及脂肪间充质干细胞的诱导培养，具体涉及一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。
技术介绍
干细胞是机体各个组织和器官的最初来源，具有增殖及分化的能力，随着医疗技术的快速发展，其在细胞移植，组织工程以及再生医学方面发挥了重要作用。尤其骨组织工程是组织工程领域中发展最为快速的学科，干细胞则是组织工程的主要种子细胞。脂肪间充质干细胞（adipose-derivedstemcells，ADSCs）源自于胚胎发育时期的中胚层，是一类具有自我更新和多分化潜能的成体干细胞。其可以在特定的条件下诱导分化为脂肪、骨、软骨、胰岛β细胞和心肌等多种细胞，另外其免疫原性较低，因此，广泛应用于临床。早期表达蛋白BSP、晚期表达蛋白OCN、核机制蛋白SATB2、核心蛋白RUNX2是骨分化过程中重要的调控因子，其表达量可反映细胞的成骨能力。BSP是骨标志性蛋白，是一种硫酸化的磷蛋白和高度糖基化，能激活成骨细胞，促进骨矿化。OCN一般仅由成骨细胞表达的基质蛋白，具有调节基质钙化的作用，其浓度可以作为成骨细胞活动的标志。SATB2是新近发现的特殊富含序列结合蛋白家族的成员，它可结合到核基质结合区并以依赖的方式激活基因转录过程，可正向调节多种成骨细胞的特异性基因如BSP和OCN的表达。RUNX2是成骨分化过程中关键的调控因子，能够调控众多基因的转录，RUNX2缺失的鼠中，成骨细胞的分化完全被抑制，均不发生骨膜内成骨和软骨内成骨。川白芷素（Angenomalin）是分离自独活、川白芷等植物中的天然化合物。研究发现，独活对骨生长具有一定的促进作用。但是，尚未见川白芷素在骨组织工程中用于诱导脂肪间充质干细胞成骨分化的应用，也未见川白芷素通过调控RUNX2的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种成骨诱导剂及在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用，该诱导剂为川白芷素，通过调控RUNX2诱导脂肪间充质干细胞成骨分化。本专利技术的上述目的通过如下技术方案实现：成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。RUNX2是成骨分化过程中关键的调控因子，能够调控众多基因的转录，RUNX2缺失会导致成骨细胞的分化完全被抑制。因此，成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂可以用于诱导脂肪间充质干细胞成骨诱导分化。优选地，所述成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂为川白芷素。在一个具体实施例中，川白芷素可显著提高成骨分化调控因子RUNX2的表达水平，为有效的RUNX2表达激活剂。川白芷素用作干细胞成骨分化诱导剂的用途。在一个具体实施例中，将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。川白芷素用作脂肪间充质干细胞成骨分化诱导剂的用途。在一个具体实施例中，将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。川白芷素在体外诱导干细胞成骨分化方面的应用。在一个具体实施例中，将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。川白芷素在体外诱导脂肪间充质干细胞成骨分化方面的应用。在一个具体实施例中，将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。川白芷素在制备脂肪间充质干细胞成骨分化诱导培养基方面的应用。因为川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用，所以可以将川白芷素用于制备脂肪间充质干细胞成骨分化诱导培养基。有益效果：RUNX2是成骨分化过程中关键的调控因子，能够调控众多基因的转录，RUNX2缺失会导致成骨细胞的分化完全被抑制。本专利技术发现，川白芷素可显著提高脂肪间充质干细胞成骨分化调控因子RUNX2的表达水平，为有效的RUNX2表达激活剂；将川白芷素作用于脂肪间充质干细胞，茜素红染色结果发现川白芷素可以显著提高细胞钙矿化结节程度，表明川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。附图说明图1为免疫细胞化学法对ADSCs的表面标记检测结果（流式检测），其中：A为CD29-FITC图，B为CD44-FITC图，C为CD14-FITC图，D为CD45-FITC图；该结果可见CD29和CD44强表达，而CD14和CD45低表达，符合ADSCs的免疫学特点。图2为茜素红染色结果。与空白对照组相比，阳性对照组出现明显的钙矿化结节；与阳性对照组相比，川白芷素组钙矿化结节程度显著更高。该结果表明，川白芷素对ADSCs成骨分化具有显著的诱导作用。图3为Westernblot结果。与空白对照组相比，阳性对照组成骨分化调控因子RUNX2的表达显著升高；与阳性对照组相比，川白芷素组成骨分化调控因子RUNX2的表达更高。该结果表明，川白芷素是通过调控成骨分化调控因子RUNX2的表达诱导ADSCs成骨分化。具体实施方式下面具体介绍本专利技术实质性内容，但并不以此限定本专利技术的保护范围。一、实验材料清洁级家兔，雌雄不拘，体重约1.2kg，适应性喂养1周后备用。胎牛血清、DMEM培养基为Gibo公司产品；CD14为CALTAG公司产品，CD29、CD44为CHEMCON公司产品，CD45为ANTIGENIX公司产品。RUNX2单抗和二抗为Abcam产品。川白芷素（Angenomalin）为诗丹德公司产品，HPLC纯度≥98%。二、实验方法1、ADSCs的分离制备、培养和表型鉴定将家兔麻醉后，取出两侧腹沟处的脂肪组织，剪碎并匀浆，用0.075%胶原酶Ⅰ消化，过300目筛网，于4℃条件下1200r/min离心5min，弃去上层脂肪和上清液，沉淀先用PBS洗涤3次，再用含10%胎牛血清的DMEM培养基（完全培养基）洗涤，离心收集沉淀，接种于培养瓶内，于37℃、5%CO2、饱和湿度条件培养24h，弃去原培养液，PBS洗涤2次去除未贴壁残渣，再加入完全培养基继续培养，每3~4d换液1次，当瓶壁基本长满了原代培养细胞时，用0.25%胰蛋白酶消化，进行传代培养。取第3代ADSCs，用免疫细胞化学法对ADSCs的表面标记进行检测：加入抗体CD29、CD44、CD14和CD45，用流式细胞仪按说明书检测细胞表面特异性抗原。2、川白芷素对ADSCs成骨分化的诱导作用取第3代ADSCs，用0.25%胰蛋白酶消化，制成浓度为1×106/mL的细胞悬液，接种于24孔板，随机分为阳性对照组、川白芷素组和空白对照组，24h后阳性对照组换成成骨诱导液（含10%胎牛血清、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、10-7mol/L地塞米松、50mg/L左旋抗坏血酸的DMEM培养基），川白芷素组在阳性对照组成骨诱导液基础上增加5μM川白芷素，空白对照组只添加完全培养基，每间隔2d更换诱导液，诱导14d后茜素红染色，在倒置显微镜下观察、拍照。茜素红染色方法如下：①1%茜素红配制：0.1mol/L的tris-HCl100ml加入0.1g茜素红S，4℃本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。

【技术特征摘要】
1.成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂在脂肪间充质干细胞成骨诱导分化中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，所述成骨分化调控因子RUNX2表达激活剂为川白芷素。3.川白芷素用作干细胞成骨分化诱导剂的用途。4.川白...

【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：杨姣姣，
类型：发明
国别省市：江苏,32