一种利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法技术

为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQ ID NO.1所示的质粒、如SEQ ID NO.2所示的质粒和如SEQ ID NO.3所示的质粒。本公开还提供了该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。

An engineering strain and method for preparation of acacine from cellulose

In order to achieve the above purposes, on the one hand, the present disclosure provides an engineering strain, the engineering strain is Escherichia coli with preservation number CGMCC NO. 14817. The present disclosure also provides a method for preparing engineered bacteria, which includes: the transformation of recombinant plasmids into the host bacteria of engineered bacteria so that the host bacteria of the engineered bacteria can express the inserted genes in the recombinant plasmids; the recombinant plasmids include the plasmids as shown in SEQ ID NO.1, as shown in SEQ ID NO.2 and as shown in SEQ ID NO.3. The present disclosure also provides engineering bacteria prepared by the method, the use of the above engineering bacteria and engineering bacteria, and a method for preparing Acacia from cellulose. The present disclosure significantly improves the production rate of Acacia by fermentation of cellulose hydrolysate through the above technical scheme.

【技术实现步骤摘要】
一种利用纤维素制备金合欢烯的工程菌株及方法
本公开涉及生物工程领域，具体地，涉及一种工程菌株、一种制备工程菌的方法、该方法制备得到的工程菌、上述工程菌株和工程菌的用途以及一种利用纤维素制备金合欢烯的方法。
技术介绍
金合欢烯可加氢转化为金合欢烷，是一种可再生、可与石化柴油和航天燃料混合使用的燃料。金合欢烯具有不含硫、高十六烷值、低温性能和低GHG排放的优点，是一种应用广泛且效果理想的生物基化学品。例如，CN101553558A描述了在大肠杆菌中利用含有葡萄糖的培养基通过MEV途径生成金合欢烯。通过微生物法生产金合欢烯需要解决的一个重要问题是葡萄糖的来源问题。纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上，是一种重要的葡萄糖来源。具体地，纤维素是由D-葡萄糖通过β-1,4-糖苷键联结而成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，是植物细胞壁的主要成分。例如，棉花的纤维素含量接近100％。纤维素通常与半纤维素、果胶和木质素结合在一起。例如一般木材中，纤维素占40～50％，还有10～30％的半纤维素和20～30％的木质素。纤维素只有在降解为葡萄糖以后，才能被微生物工程菌作为碳源利用。在实际生产中，作为纤维素的来源的原材料主要包括秸秆、树皮、木屑、玉米芯、米糠和麦麸等，这些原材料中纤维素往往形成一种具有高度结晶区的超分子稳定结构，同时其周围紧密镶嵌着半纤维素和木质素，从而形成复杂稳定的结构，其使得纤维素很难直接被微生物直接利用。目前，通常对作为纤维素的来源的原材料先进行预处理和酶解，在将得到的含有单糖的产物送入发酵过程。例如，已有的预处理方法主要有稀酸处理、热液处理、蒸汽爆破、有机溶剂处理、低温氨浸处理、碱液处理、碱性过氧化氢处理和生物法处理等。又例如，已有的酶解包括纤维素酶和/或β-葡萄糖苷酶的酶解。然而，在研究过程中发现，纤维素水解产生含有单糖的产物如果用于金合欢烯的发酵生产，存在着产率低下的缺陷。
技术实现思路
本公开的目的之一是提高利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。为了实现上述目的，一方面，本公开提供了一种工程菌株，该工程菌株是保藏编号为CGMCCNO.14817的大肠杆菌。另一方面，本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQIDNO.1所示的pMevT质粒、如SEQIDNO.2所示的pMBIS质粒和如SEQIDNO.3所示的pFII质粒。另一方面，本公开还提供了上述方法制备得到的工程菌。另一方面，本公开还提供了上述工程菌株或上述方法制备得到的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。再一方面，本公开还提供了一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其中，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种如上所述的工程菌株或工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯存在着产率低下的原因可能在于菌株本身的抗逆性较差或合成能力较差，通过选取合适的载体、代谢通路、基因排布顺序和启动子组合应用以平衡代谢通路，能显著地提高工程菌的抗逆性。因此，本公开通过上述技术方案，显著地提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。生物保藏本公开涉及到的生物保藏信息包括：分类命名为：大肠埃希氏菌Escherichiacoli；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心；地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏日期为：2017年10月16日；保藏编号为：CGMCCNO.14817。具体实施方式以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。一方面，本公开提供了一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCCNO.14817的大肠杆菌。大肠杆菌是指大肠埃希氏菌Escherichiacoli。其中，保藏编号为CGMCCNO.14817的大肠杆菌是在根据制备工程菌的方法制备工程菌的过程中，出乎意料地得到的一个具有较高活性的克隆，由此得到了具有效果更好的工程菌株。本公开还提供了一种制备工程菌的方法，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQIDNO.1所示的pMevT质粒、如SEQIDNO.2所示的pMBIS质粒和如SEQIDNO.3所示的pFII质粒。可选地，其中，所述工程菌为大肠杆菌。可选地，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。其中，由如SEQIDNO.1所示的pMevT质粒、如SEQIDNO.2所示的pMBIS质粒和如SEQIDNO.3所示的pFII质粒三者组成的重组质粒使得所述工程菌中能够具有异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)、金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA)和金合欢烯合成酶(FG)的表达，并且能够具有组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶的表达；并且这种特定组合的重组质粒能够使得工程菌中各种代谢酶的表达量构成了高效的平衡代谢通路，由此提高了利用纤维素水解产物发酵生产金合欢烯的产率。其中，所述组成甲羟戊酸(MVA)途径的多种酶包括乙酰乙酰基CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、甲羟戊酸激酶(E12)、磷酸甲羟戊酸激酶(E8)和甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)；所述乙酰乙酰基CoA硫解酶为atoB酶；所述HMG-CoA合酶为HMGS酶，所述HMG-CoA还原酶为HMGR酶。其中，本公开中所涉及到的各种酶的物种来源、氨基酸序列和核苷酸编码序列可以为已知的选择。例如，异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)是指编号为EC5.3.3.2的酶，其来源及序列可以为已知的物种来源和序列(包括人工序列)。表1中给出了本公开中所涉及到的各种酶的参考信息，但本公开中所涉及到的各种酶的选取和使用并不局限于表1中的信息。表1酶的名称酶学编号参考编码序列异戊烯焦磷酸异构酶(IDI)EC5.3.3.2SEQIDNO.2中7197-744位金合欢烯焦磷酸合成酶(ispA)EC2.5.1.10SEQIDNO.2中7767-8666位金合欢烯合成酶(FG)EC4.2.3.47SEQIDNO.3中5069-6792位atoB酶EC2.3.1.9SEQIDNO.1中1320-2503位HMGS酶EC2.3.3.10SEQIDNO.1中2519-3993位HMGR酶EC1.1.1.34SEQIDNO.1中4009-7145位甲羟戊酸激酶(E12)EC2.7.1.36SEQIDNO.2中3535-4565位磷酸甲羟戊酸激酶(E8)EC2.7.4.2SEQIDNO.2中4588-5943位甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶(MVD1)EC4.1.1.33SEQIDNO.2中5975-7164位另一方面，本公开还提供了如上所述的方法制备得到的工程菌。另一方面，本公开还提供了如上所述的工程菌株或如上所述的工程菌在利用纤维素水解产物进行发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCC NO.14817的大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种工程菌株，其特征在于，该工程菌株是保藏编号为CGMCCNO.14817的大肠杆菌。2.一种制备工程菌的方法，其特征在于，该方法包括：对工程菌宿主菌进行重组质粒的转入，使得转入后的所述工程菌宿主菌能够表达所述重组质粒中所插入的基因；所述重组质粒包括如SEQIDNO.1所示的pMevT质粒、如SEQIDNO.2所示的pMBIS质粒和如SEQIDNO.3所示的pFII质粒。3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述工程菌为大肠杆菌。4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述大肠杆菌为大肠杆菌DH5α和/或大肠杆菌BL21。5.权利要求2-4中任意一项所述的方法制备得到的工程菌。6.权利要求1所述的工程菌株或权利要求5所述的工程菌在利用纤维素水解产物进行发酵产生金合欢烯中的用途。7.一种利用纤维素制备金合欢烯的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)将含有纤维素的固态原料进行水解处理，得到含有单糖的水解产物；(2)在包括所述含有单糖的水解产物的液态发酵原料中接种权利要求1所述的工程菌株或权利要求5所述的工程菌，并进行发酵培养，得到培养后的物料。8.根据权利要求7所述的方法，其中，将含有纤维素的原料进行水解处理的步骤包括：S1、将含有纤维素的固态原料先后进行酸预处理和碱预处理，或者先后进行碱预处理和酸预处理，；S2、将所述预处理后的固态物料进行酶促水解；所述酸预处理为甲酸处理和/或稀硫酸处理；所述甲酸处理的条件包括：温度为40～100℃，时间为1～10小时，相对每千克预处理的固体物料，甲酸溶液的体积为5～50升，所述甲酸溶液含有70～95wt％的甲酸和0～2wt％的HCl；所述稀硫酸处理的...

【专利技术属性】
技术研发人员：高岚，齐崴，尤生萍，陶志平，李妍，苏荣欣，李宝石，蔺建民，
申请(专利权)人：中国石油化工股份有限公司，中国石油化工股份有限公司石油化工科学研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11