抑制Rac1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域，具体公开了一种抑制Rac1表达的干扰RNA及其在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用，其中还公开了一种乳腺癌化疗药物，包括上述的抑制Rac1表达的干扰RNA、化疗药物以及用于运输所述干扰RNA和所述化疗药物的肿瘤微环境响应的载体。本发明专利技术采用酸敏的纳米材料作为载体，能高效输送siRNA和化疗药物到肿瘤细胞内，在血液中的循环时间较长，在肿瘤中富集量高；同时包载有siRNA和化疗前体药物，能够高效沉默靶基因，有效抑制耐药基因表达，同时，增强对肿瘤细胞的杀伤，显著提高肿瘤化疗效果，对正常组织细胞毒副作用小，并且对心、肝等重要器官无明显损伤。

Interfering RNA Inhibiting Rac1 Expression and Its Application in Increasing Chemosensitivity of Breast Cancer

The invention relates to the field of biomedicine, in particular to an interfering RNA that inhibits Rac1 expression and its application in increasing the chemosensitivity of breast cancer, in which a breast cancer chemotherapeutic drug is also disclosed, including the interfering RNA that inhibits Rac1 expression, a chemotherapeutic drug and a carrier for transporting the interfering RNA and the tumor microenvironment response of the chemotherapeutic drug. The invention adopts acid-sensitive nano-materials as carriers, which can efficiently transport siRNA and chemotherapeutic drugs into tumor cells, circulate in the blood for a long time and enrich in tumors; at the same time, it contains siRNA and chemotherapeutic precursors, which can effectively silence target genes, effectively inhibit the expression of drug-resistant genes, at the same time, enhance the killing of cancer cells, and significantly improve the effect of cancer chemotherapy. It has little cytotoxic side effects on normal tissues and no obvious damage to heart, liver and other important organs.

【技术实现步骤摘要】
抑制Rac1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用
本专利技术涉及生物领域，尤其是涉及一种抑制Rac1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用。
技术介绍
癌症发病率呈逐年上升趋势，目前已成为威胁人类健康最严重的疾病之一。目前，化疗仍是癌症治疗的基石，但是化疗药缺乏靶向性，对肿瘤细胞杀伤的同时对正常的细胞也极大的损害，这导致部分患者无法耐受化疗副作用而中断治疗。而且很多接受化疗的患者，在治疗一段后容易产生耐药性。目前，还研制了一些新型的抗癌药物，例如分子靶向药、抗体偶联药物、RNA干扰技术以及纳米药物等。已经发现在肿瘤细胞中有多种癌驱动相关基因，癌驱动相关基因在肿瘤中和在肿瘤微环境中高表达，与肿瘤的发生发展及转移密切相关。现阶段，针对癌驱动相关基因的分子靶向药(如针对HER2+肿瘤的拉帕替你)在临床上广泛使用。然而，类似于化疗药，分子靶向药同样具体毒副作用；而且患者接受分子靶向药治疗一段时间后，也容易出现耐药性。抗体偶联药物(Antibody-drugconjugates，ADCs)是将具有靶向性质的抗体和强细胞毒性的药物(主要是化疗药)偶联而成的一种新型抗肿瘤药物，主要由靶向性的抗体，偶联的药物和抗体与药物之间的连接子构成。抗体偶联药虽然可以提高化疗药物靶向性，但在血液循环中不稳定，容易分解，导致最终治疗结果不理想。RNA干扰(RNAinterference,RNAi)技术近年来发展迅速，在多种疾病的治疗应用中潜能巨大。和小分子靶向药物比较，siRNA对靶点的选择性会更好，能够特异性结合靶基因并下调靶基因表达，而且不会影响细胞中其它正常基因的表达。但是RNAi技术在临床转化时最大难题是缺少低毒高效的载体将siRNA输送到病灶部位和细胞内。对于基于RNAi技术的癌症治疗，siRNA在输送过程还需要解决一系列生理屏障，例如如何靶向肿瘤细胞、穿透肿瘤组织和细胞膜、从内涵体高效逃逸以及在细胞质内有效释放siRNA等。虽然使用传统的病毒载体如腺病毒和逆转录病毒传递siRNA可以克服上述各种生理屏障，但具有制备困难、siRNA容量小、靶向特异性差、免疫原性强等缺点。纳米药物由纳米载体和化疗药物组成，其中化疗药物被包埋在纳米载体中，是一类新的肿瘤化疗药物，如白蛋白紫杉醇和脂质体阿霉素。相对于普通的化疗药物，纳米药物改变其体内代谢方式和器官分布情况，纳米药物在提高肿瘤治疗效果的同时，显著降低毒副作用，改善肿瘤患者的生活质量；但是，目前的临床上使用的纳米药物仍具有药物释放不可控、治疗方式单一等弊端。
技术实现思路
本专利技术旨在克服上述现有技术的至少一种缺陷(不足)，专利技术提供了一种抑制Rac1表达的干扰RNA及在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用。本专利技术采取的技术方案是，一种抑制Rac1表达的干扰RNA(siRNA)，所述干扰RNA的基因序列为5’-AGACGGAGCTGTAGGTAAA-3’，如SEQNO.1所示；或，所述干扰RNA的基因序列为5’-CCTTTGTACGCTTTGCTCA-3’，如SEQNO.2所示。在之前研究中，Rac1基因主要和肿瘤的侵袭和转移相关，申请人首次发现该基因与化疗耐药性有关。Rac1在乳腺癌细胞系中比乳腺癌正常上皮细胞系MCF10A高表达，其中在三阴性乳腺癌细胞系中表达最高。因此，本专利技术通过用siRNA在乳腺癌细胞系中沉默Rac1的表达，发现敲低Rac1后，化疗药(顺铂，阿霉素，多西他赛等)在细胞针对生长能力、平板克隆和凋亡中都发挥更明显的细胞毒性作用；并且，敲低Rac1后，细胞的DNA损伤修复时间延长，也就是说，Rac1还通过影响DNA损伤来影响细胞对化疗的敏感性。本专利技术提供了一种抑制Rac1表达的干扰RNA，通过敲低Rac1提高癌细胞的化疗敏感性。因此，本专利技术提出了将靶向耐药基因Rac1的siRNA——siRac1应用于增加乳腺癌化疗敏感性。本专利技术提供了一种乳腺癌化疗药物，包括上述的抑制Rac1表达的干扰RNA、化疗药物以及用于运输所述干扰RNA和所述化疗药物的肿瘤微环境响应的载体。本方案使用对肿瘤微环境响应(如酸响应、乏氧响应、酶响应等)的纳米载体材料，同时包载靶向耐药基因的siRNA和化疗药物。由于这些纳米载体能在血液循环和正常生理组织中稳定存在；到达肿瘤部位后，能够对肿瘤细胞内外微环境做出快速响应，加快siRNA的释放效率，显著提高基因治疗效果并减轻毒副作用；同时该纳米载体材料还同时负载siRNA和化疗药物，可显著抑制与化疗耐药相关基因表达，提高化疗敏感性，协同杀伤肿瘤细胞并降低对正常组织细胞的损伤。进一步地，所述载体为酸性pH响应的高分子聚合物。进一步地，所述载体的响应pH值为6.0～6.5。研究发现，人体正常血液循环及组织的pH约为7.4，而肿瘤区域由于其代谢旺盛，处在缺氧环境中，有过多的乳酸代谢物产生，使肿瘤组织微环境呈弱酸性(pH6.5)，此外，细胞内涵体的基质环境pH值约为5.5～6.0。本专利技术使用该材料制备的纳米载体共输送siRNA和化疗药物时，能够对内涵体的酸性pH做出响应，加快siRNA和化疗药物的胞内释放，沉默化疗耐药相关的靶基因并增加化疗敏感性，协同杀伤肿瘤细胞。优选地，所述纳米载体的响应pH值为6.24。进一步地，所述纳米载体为嵌段聚合物聚乙二醇-b-聚(2-(二异丙基氨基)乙基甲基丙烯酸酯)(Polyethyleneglycol-b-poly(2-(diisopropylamino)ethylmethacrylate),PEG-b-PDPA)。本专利技术所采用的酸敏高分子材料为PEG-b-PDPA，该酸敏高分子材料的pKa为6.24。进一步地，所述化疗药物包括顺铂前药(DDPprodrug)、阿霉素(DOX)或多西他赛(DTX)。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：(1)本专利技术提供了一种抑制Rac1表达的干扰RNA，该干扰RNA能够高效的抑制Rac1基因的表达。由于Rac1与乳腺癌的化疗耐药有关，并且和乳腺癌的分期及生存预后相关，其通过影响细胞的DNA损伤进而影响细胞的化疗敏感性。本专利技术通过敲低Rac1能够提高癌细胞的化疗敏感性。(2)本专利技术所提供的乳腺癌化疗药物采用酸敏的纳米材料作为载体，能高效输送siRNA和化疗药物到肿瘤细胞内，在血液中的循环时间较长，在肿瘤中富集量高；同时包载有siRNA和化疗药物，siRNA能够高效沉默靶基因，有效抑制耐药基因表达，再结合化疗药物能够大大增强对肿瘤细胞的杀伤，显著提高肿瘤化疗效果，且对正常组织细胞毒副作用小，对心、肝等重要器官无明显损伤。附图说明图1为靶向化疗制剂的纳米粒子的尺寸分布图。图2为靶向化疗制剂的纳米粒子微观形貌图。图3为靶向化疗制剂在不同pH水溶液中释放曲线。图4为载有荧光染料标记siRNA和顺铂前药的纳米粒子与细胞培养1小时和4小时后荧光照片。图5为敲低Rac1对于化疗药对细胞生长能力的影响。图6为敲低Rac1对于化疗药对细胞克隆形成能力的影响。图7为敲低Rac1对于化疗药导致的细胞凋亡情况的影响。图8为敲低Rac1对于化疗药对细胞DNA的损伤的影响(γ-H2AX为DNA损伤标志)。图9为敲低Rac1对于DNA的损伤修复的影响(γ-H2AX为DNA损伤标志)。图10为纳米粒子在不同浓度本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抑制Rac1表达的干扰RNA，其特征在于，所述干扰RNA的基因序列为5’‑AGACGGAGCTGTAGGTAAA‑3’。

【技术特征摘要】
1.一种抑制Rac1表达的干扰RNA，其特征在于，所述干扰RNA的基因序列为5’-AGACGGAGCTGTAGGTAAA-3’。2.一种抑制Rac1表达的干扰RNA，其特征在于，所述干扰RNA的基因序列为5’-CCTTTGTACGCTTTGCTCA-3’。3.根据权利要求1或2所述的抑制Rac1表达的干扰RNA在增加乳腺癌化疗敏感性中的应用。4.一种乳腺癌化疗药物，其特征在于，包括根据权利要求1或2所述的抑制Rac1表达的干扰RNA、化疗药物以及用于运输所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚和瑞，许小丁，胡海，李青剑，毕卓菲，
申请(专利权)人：中山大学孙逸仙纪念医院，
类型：发明
国别省市：广东,44