新颖腺相关病毒衣壳蛋白制造技术

本发明专利技术涉及新颖腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白、包括新颖衣壳蛋白的AAV颗粒、对这些衣壳蛋白进行编码的多核苷酸以及表达这些衣壳蛋白的AAV载体。本发明专利技术还涉及制作本文所述的表达本发明专利技术的新颖衣壳蛋白的AAV载体的方法及其相关的治疗用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新颖腺相关病毒衣壳蛋白本申请要求于2017年7月26日提交的美国临时申请号62/366,383的优先权权益，其通过引用以其整体并入本文。
本专利技术涉及新颖腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白、包括新颖衣壳蛋白的AAV颗粒、对这些衣壳蛋白进行编码的多核苷酸以及表达这些衣壳蛋白的AAV载体。本专利技术还涉及制作本文所述的表达本专利技术的新颖衣壳蛋白的AAV载体的方法及其相关的治疗用途。
技术介绍
AAV是复制缺陷型细小病毒，其单链DNA基因组长度为约4.7kb，包括145个核苷酸反向末端重复(ITR)。AAV血清型2(AAV2)基因组的核苷酸序列在如由Ruffing等人《普通病毒学杂志(JGenVirol)》75:3385-3392(1994)校正的Srivastava等人《病毒学杂志(JVirol)》45:555-564(1983)中提出。指导病毒DNA复制(rep)、衣壳化/包装和宿主细胞染色体整合的顺式作用序列包含在ITR中。三个AAV启动子p5、p19和p40(针对其相对图谱位置命名)驱使编码rep和cap基因的两个AAV内部开放阅读框的表达。与单个AAV内含子的差异剪接(在核苷酸2107和2227处)偶联的两个rep启动子(p5和p19)导致由rep基因产生四种rep蛋白(rep78、rep68、rep52和rep40)。Rep蛋白具有多种酶特性，其最终负责复制病毒基因组。cap基因由p40启动子表达，并且其编码三种衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。替代性剪接和非共有转译起始位点负责产生三种相关的衣壳蛋白。单一共有聚腺苷酸化位点位于AAV基因组的图谱位置95处。AAV的生命周期和遗传学在Muzyczka,《当前微生物学和免疫学的话题(CurrentTopicsinMicrobiologyandImmunology)》,158:97-129(1992)中评论。当AAV感染人细胞时，病毒基因组可以整合到19号染色体中，从而导致细胞潜伏感染。除非细胞被辅助病毒(例如，腺病毒或疱疹病毒)感染，否则不会产生感染性病毒。在腺病毒的情况下，基因E1A、E1B、E2A、E4和VA提供辅助功能。在用辅助病毒感染后，拯救并扩增AAV原病毒，并产生AAV和腺病毒两者。AAV具有独特的特征，这使其作为用于表达免疫基因肽/多肽的疫苗载体和作为用于将外源DNA递送到细胞的载体具有吸引力，例如，在基因疗法中。培养中细胞的AAV感染是非细胞病变的，并且人和其它动物的自然感染是沉默的且无症状的。此外，AAV感染许多哺乳动物细胞，从而允许体内靶向许多不同组织的可能性。AAV原病毒基因组作为质粒中的克隆DNA具有感染性，这使得重组基因组的构建成为可能。此外，由于指导AAV复制、基因组衣壳化和整合的信号包含在AAV基因组的ITR中，因此部分或全部内部约4.3kb的基因组(编码复制和结构衣壳蛋白，rep-cap)可以用外源DNA如含有启动子、所关注DNA和聚腺苷酸化信号的基因盒替换。rep蛋白和cap蛋白可以以反式提供。AAV的另一个显著特征是其是极其稳定且强健的病毒。它易于承受用于灭活腺病毒的条件(56℃到65℃持续数小时)，这使rAAV载体的冷保存不太重要。甚至可以将AAV冻干。最后，AAV感染的细胞不耐受重复感染。AAV载体可用于许多哺乳动物基因疗法应用中，并且需要可用于基因疗法应用的新的和/或修饰的AAV载体和相关病毒。本专利技术提供了表达本专利技术的新颖AAV衣壳蛋白或功能性嵌合工程化AAV衣壳蛋白的新颖AAV载体、以及包括那些载体或衣壳蛋白的新颖、非天然存在的AAV病毒体。
技术实现思路
本专利技术提供了新颖AAV衣壳蛋白，其可以是新颖VP1、VP2或VP3衣壳蛋白、包括任何这些衣壳蛋白的非天然存在的AAV病毒、以及用于基因疗法应用和用于制备用于基因疗法应用的药物的这种AAV病毒的用途。在一些实施例中，从各种哺乳动物组织中分离和识别AAV衣壳蛋白。某些新颖哺乳动物衍生的AAV衣壳VP1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO：15-89所示，并且本文还描述了对应的VP2和VP3序列的相关位置。此外，本专利技术提供了新颖工程化嵌合AAV衣壳蛋白，其具有衍生自一个AAV衣壳序列的骨架氨基酸序列和衍生自至少一个不同AAV衣壳序列的衣壳蛋白序列的片段。示例性工程化嵌合AAV衣壳VP1蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:90到157所示。总体而言，新颖衣壳蛋白被在本文中称为“本专利技术的AAV衣壳蛋白”。当就本文所述的任何物质组合物使用时，术语“非天然存在的”是指所述组合物不是天然产物，而是通过重组或其它方法人工合成的。在一个实施例中，本专利技术提供了一种载体和腺相关病毒(AAV)，所述AAV具有衣壳蛋白，所述衣壳蛋白具有与以下至少95％相同的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区，并且所述AAV进一步具有转基因，其中所述转基因由与控制异源基因在宿主细胞中的表达的调节序列可操作地连接的异源基因构成。在另一个实施例中，所述衣壳蛋白具有以下的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ⅱ)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区。在又另一个实施例中，所述AAV具有AAV反向末端重复序列。在另外的实施例中，所述AAV与生理学上相容的载剂混合。在另一个实施例中，本专利技术提供了一种载体和具有嵌合衣壳蛋白的AAV，其中所述嵌合衣壳蛋白具有带有可变区I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX的受体骨架AAV衣壳的VP1氨基酸序列，除其中可变区I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX中的一个或多个被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应可变区替代之外。在另一个实施例中，受体衣壳的仅一个可变区被来自所述供体衣壳的相应可变区替代。在另外的实施例中，所述受体衣壳的两个或更多个可变区被来自单个供体AAV衣壳的相应可变区替代。在又另一个实施例中，所述受体AAV衣壳的两个或更多个可变区被来自两个或更多个供体AAV衣壳的相应可变区替代。在另一个实施例中，所述受体AAV衣壳的所有九个可变区被来自单个供体衣壳的相应可变区替代。在又另一个实施例中，所述受体AAV衣壳具有GBS区或GH环区，并且所述GBS区或所述GH环区被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应区替代。在另外的实施例中，所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述GBS区被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应可变区和GBS区替代。在又另一个实施例中，所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述GBS区被来自两个或更多个供体AAV衣壳的相应区和GBS区替代。在另一个实施例中，所述受体AAV衣壳的GH环被来自供体AAV衣壳的相应GH环区替代。在另外的实施例中，所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述GH环区被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应可变区和GH环区替代。在一个实施例中，所述受体AAV衣壳序列是SEQIDNO:1到14中的任一个，并且所述供体AAV衣壳序列选自SEQIDNO:1到14中的任一个，并且其中所述受体AAV衣壳与所述供本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种腺相关病毒(AAV)，其包括衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与以下至少95％相同的氨基酸序列：(i)SEQ ID NO:15到89中的任一个；(ii)SEQ ID NO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQ ID NO:15到89中的任一个的VP3区，并且所述AAV进一步包括转基因，所述转基因包括异源基因，所述异源基因与控制所述异源基因在宿主细胞中的表达的调节序列可操作地连接。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.26 US 62/366,8381.一种腺相关病毒(AAV)，其包括衣壳蛋白，其中所述衣壳蛋白包括与以下至少95％相同的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区，并且所述AAV进一步包括转基因，所述转基因包括异源基因，所述异源基因与控制所述异源基因在宿主细胞中的表达的调节序列可操作地连接。2.根据权利要求1所述的AAV，其中所述衣壳蛋白包括以下的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ⅱ)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区。3.根据权利要求1或2所述的AAV，其进一步包括AAV反向末端重复。4.一种组合物，其包括根据权利要求1到3中任一项所述的AAV以及生理学上相容的载剂。5.一种将转基因递送到细胞的方法，其包括使所述细胞与根据权利要求1到3中任一项所述的AAV接触。6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞是肌细胞。7.根据权利要求5或6所述的方法，其中所述转基因对微抗肌萎缩蛋白进行编码。8.一种治疗患有与内源性蛋白的异常活性相关的病症或疾病的受试者的方法，其包括将有效量的包括衣壳蛋白的AAV施用给所述受试者，其中所述衣壳蛋白包括与以下至少95％相同的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区，并且其中所述AAV包括对所述蛋白的生物活性拷贝进行编码的转基因。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述病症或疾病是杜氏肌营养不良症，并且其中所述转基因对微抗肌萎缩蛋白进行编码。10.一种载体，其包括对腺相关病毒(AAV)衣壳蛋白进行编码的核酸序列，所述AAV衣壳蛋白具有与以下至少95％相同的氨基酸序列：(i)SEQIDNO:15到89中的任一个；(ii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP2区；或(iii)SEQIDNO:15到89中的任一个的VP3区。11.根据权利要求10所述的载体，其中所述核酸序列与控制所述衣壳蛋白在宿主细胞中的表达的异源调节元件可操作地连接。12.一种细胞，其包括根据权利要求10或11所述的载体。13.一种根据权利要求1到3中任一项所述的AAV在制备用于治疗病症或疾病的药物中的用途。14.根据权利要求13所述的用途，其中所述病症或疾病与内源性蛋白的异常活性相关，并且进一步地其中所述AAV包括对所述蛋白的生物活性拷贝进行编码的转基因。15.根据权利要求14所述的用途，其中所述病症或疾病是杜氏肌营养不良症，并且所述转基因对微抗肌萎缩蛋白进行编码。16.一种组合物，其包括根据权利要求1到3中任一项所述的AAV，用于治疗疾病或病症。17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述病症或疾病是杜氏肌营养不良症，并且所述转基因对微抗肌萎缩蛋白进行编码。18.一种腺相关病毒(AAV)，其包括嵌合衣壳蛋白，所述嵌合衣壳蛋白具有包括可变区I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII和IX的受体骨架AAV衣壳的VP1氨基酸序列，不同之处在于其中可变区I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII或IX中的一个或多个被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应可变区替代。19.根据权利要求18所述的AAV，其中来自所述受体AAV衣壳的仅一个可变区被来自所述供体AAV衣壳的相应可变区替代。20.根据权利要求18所述的AAV，其中来自所述受体AAV衣壳的两个或更多个可变区被来自单个供体AAV衣壳的相应可变区替代。21.根据权利要求18所述的AAV，其中来自所述受体AAV衣壳的两个或更多个可变区被来自两个或更多个供体AAV衣壳的相应可变区替代。22.根据权利要求18所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳的所有九个可变区被来自单个供体AAV衣壳的相应可变区替代。23.根据权利要求18到22中任一项所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳进一步包括GBS区或GH环区，并且所述GBS区或所述GH环区被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应区替代。24.根据权利要求23所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述GBS区被来自一个或多个供体AAV衣壳的相应可变区和GBS区替代。25.根据权利要求23所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述GBS区被来自两个或更多个供体AAV衣壳的相应可变区和GBS区替代。26.根据权利要求23所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳的所述GH环被来自供体AAV衣壳的相应GH环区替代。27.根据权利要求23所述的AAV，其中所述受体AAV衣壳的所有九个可变区和所述G...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·C·克罗希，M·洛什瑞，R·吴，
申请(专利权)人：生物马林药物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国,US