一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法技术

本发明专利技术属于水产生物技术领域，公开了一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法，采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ ID NO：1；基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物；采集中华鳖裙边组织，提取中华鳖基因组DNA，利用引物对在中华鳖个体中进行扩增；扩增结果进行电泳检测；进行遗传性别的鉴定。本发明专利技术解决了目前尚未见到中华鳖性别特异性标记用于遗传性别的鉴定，具有原创性。本发明专利技术准确鉴定成功率达到100％。

A Molecular Marker and Method for Gender Identification of Trionyx sinensis

The invention belongs to the field of aquatic biotechnology, and discloses a molecular marker and method for genetic sex identification of soft-shelled turtle. RAD technology is used to sequence male and female individuals and screen male and female specific fragments; according to male and female specific fragments, female genome Walking is carried out to obtain 6532 BP specific fragment SEQ ID NO:1; and primers are designed based on specific fragments. Specific primers were obtained by primer screening and validation; the skirt tissue of soft-shelled turtle was collected to extract the genomic DNA of soft-shelled turtle, and the primers were used to amplify the genomic DNA of soft-shelled turtle; the amplified results were detected by electrophoresis; and the genetic sex was identified. The invention solves the problem that the sex-specific marker of soft-shelled turtle has not yet been seen for genetic sex identification, and has originality. The accurate identification success rate of the invention reaches 100%.

【技术实现步骤摘要】
一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法
本专利技术属于水产生物
，尤其涉及一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：中华鳖(Pelodiscussinensis)属爬行纲、龟鳖目、鳖科、鳖属，俗称甲鱼、水鱼、团鱼。在世界范围内，鳖主要分布于亚洲、非洲及北美，在亚洲主要分布于中国、俄罗斯东部、朝鲜、日本和越南。在我国分布范围广泛，除西藏、青海及新疆外各省市、自治区均有分布。由于其具有较高的营养价值和药用价值，一直以来深受广大消费者的喜爱。近些年来，中华鳖养殖业也得到较快发展，养殖产量在2016年已经达到34.5万吨。中华鳖呈现明显的雌雄异速生长，雄性生长速度快于雌性，且雄性的裙边宽厚，雄性苗种的价格较雌性高，雄性苗种深受广大养殖企业和养殖户的欢迎。因此，全雄或高雄性中华鳖苗种的培育将极大地提高养殖产量，增加养殖效益，中华鳖的性别控制育种也业已成为重要的研究课题。目前中华鳖单性苗种生产常用的方法是人工挑选。孵化后的苗种经人工养殖一段时间，在出现明显异形特征时通过外部形态进行判别，目前通常以尾的长短作为第一辨别特征，雌性个体尾短，尾端不或很少自然伸出裙边外；雄性个体尾长，能够自然伸出裙边。虽然人工挑选的方法简单易行，但是对于尾部特征不明显的个体或者幼鳖鉴定效果较差，同时还必须在养殖到出现明显的外形判别特征时才能进行，需要将雌雄性苗种同时养殖一段时间，一般在温室养殖情况下需要3-4个月，在外塘养殖时间更长，而规格苗种出售时，通常养殖企业和养殖户只购买雄性苗种，绝大部分雌性个体只能作为商品鳖销售，而价格相对较低，直接影响了中华鳖苗种养殖的经济效益。采用激素诱导性逆转和遗传学相结合的方法是中华鳖单性苗种生产的另外一条途径，也是目前研究的重点方向。该方法研究的基础是必须获得性逆转个体，进而准确鉴定出性逆转个体，也就是准确鉴定出生理性别和遗传性别不一致的个体。中华鳖遗传性别的鉴定对于开展中华鳖性别诱导、性别控制技术研究、中华鳖育种方案的制定和育种计划的有效管理具有重要的作用。因此专利技术一种可以用于中华鳖遗传性别鉴定的方法尤其必要。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)通常在生产实践中，现有常规技术主要是通过对中华鳖外形特征进行生理性别的鉴定，但是对于规格较小或外形特征不明显的中华鳖苗种，难以准确鉴定，鉴定效果不佳。(2)在科研工作中，也可以通过组织切片等方式对中华鳖的生理性别进行鉴定，但是需要解剖采集性腺组织，造成中华鳖的死亡。(3)在未发生性逆转，遗传性别与生理性别一致，通过生理性别可以间接鉴定遗传性别；但是如果是性逆转个体，遗传性别与生理性别不一致，无法通过生理性别的鉴定得到其遗传性别。(3)在进行中华鳖性别控制研究时，中华鳖群体可能同时存在性逆转个体和未性逆转个体，外形鉴定和组织切片鉴定均无法获得真正的遗传性别。解决上述技术问题的难度：可以通过开发准确高效的性别特异性分子标记准确地中华鳖遗传性别，目前虽然性别特异性标记开发的技术方法很多，一些技术方法也均可以实现，不存在显著的技术障碍，但是在分子标记开发的过程中存在很大的不确定性，与使用的中华鳖群体、筛选分子标记的类型、采用分析方法、参数阈值的设置等都有密切的关系。解决上述技术问题的意义：中华鳖性别特异性标记的开发，不仅能实现早期对常规孵化苗种的遗传性别进行鉴定，促进单性苗种的培育和养殖，极大提高经济效益，而且对于开展中华鳖性别决定、性别控制和全雄苗种研究具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于中华鳖遗传性别鉴定的分子标记及方法。本专利技术是这样实现的，一种用于中华鳖遗传性别鉴定方法，所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQIDNO：1；基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物；采集打孔器进行打孔采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；利用基于特异性片段SEQIDNO：1开发的引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增；扩增结果进行电泳检测；进行遗传性别的鉴定。进一步，基于特异性片段设计引物中，引物包括：引物组1：Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA；Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA；引物组2：Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC；Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC。进一步，采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序前需进行鉴定样本的收集；采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为Female，雄性记为Male。进一步，提取中华鳖基因组DNA包括：(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中；(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOMbuffer，55℃消化4～6h；(3)加入500μL4.5MNaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀20min，再13000rpm离心10min；(5)弃上清液，加入500μL75％乙醇，置于55℃下消化5min，然后13000rpm离心5min；(6)弃去上清液，将试管倒立在吸水纸上，室温下自然干燥；(7)加100μL超纯水溶解DNA，4℃过夜；(8)用1％的琼脂糖凝胶进行DNA检测后，在-20℃下保存备用。进一步，步骤利用引物对Female1F/Female1R在中华鳖个体中进行扩增包括：94℃预变性5min，25-40个循环，72℃延伸10min，4℃保存；94℃变性40sec，引物组150℃退火，引物组262℃30sec，72℃延伸1min。进一步，扩增结果进行电泳检测包括：扩增结束后，取2μLPCR扩增产物和2μL溴酚蓝混混匀后，在在1.5-2.0％的琼脂糖凝胶上上样，在最左边上样DL2000marker，120V电压，电泳30min关掉电源，然后用凝胶成像系统进行电泳结果的分析。进一步，进行遗传性别的鉴定包括：单个引物组进行单独判定：引物1或引物2进行电泳；两个引物组进行联合判定：两个引物组分别进行电泳，根据电泳结果进行联合判定。本专利技术的另一目的在于提供一种方法于所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法的分子标记为SEQIDNO：1。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：本专利技术提供的采用打孔器用于中华鳖样本收集的方法，对中华鳖个体损伤较小，不对其成活造成影响。本专利技术提供的中华鳖遗传性别鉴定分子标记和鉴定方法，操作方便，简单易行，鉴定成功率高，鉴定准确率达100％。本专利技术提供的鉴定方法对于规格较小，或外形特征不明显的中华鳖个体也能准确鉴定，可进行中华鳖苗种的早期性别鉴定，可提早实现单性养殖，提高养殖产量，增加养殖效益。本专利技术可一次性快速批量准确鉴定中华鳖的遗传性别。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQ ID NO：1；基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R；采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；利用引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增；扩增结果进行电泳检测；进行遗传性别的鉴定。

【技术特征摘要】
1.一种用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，所述用于中华鳖遗传性别鉴定方法包括：采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序，筛选雌雄特异性片段；根据雌雄特异性片段进行雌性基因组Walking，获得6532bp的特异性片段SEQIDNO：1；基于特异性片段设计引物，进行引物筛选和验证获得特异性引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R；采集中华鳖裙边组织，保存在无水乙醇中；提取中华鳖基因组DNA，保存在超纯水中；利用引物组Female1F/Female1R和Female2F/Female2R在中华鳖个体中进行扩增；扩增结果进行电泳检测；进行遗传性别的鉴定。2.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，基于特异性片段设计引物中，引物包括：引物组1：Female1F：TGACTGGCACTGGAGAAGGA；Female1R：GCATCAACCACAGCCCTACA；引物组2：Female2F：TCCAGGGCAGAAAGACACTC；Female2R：ATGTCCCGGTGGATGGC。3.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，采用RAD技术对中华鳖雌雄个体进行测序前需进行鉴定样本的收集；采用打孔器在中华鳖的裙边进行打孔，采集雌雄性个体的组织样本，并保存在无水乙醇中，雌性记为Female，雄性记为Male。4.如权利要求1所述的用于中华鳖遗传性别鉴定方法，其特征在于，提取中华鳖基因组DNA包括：(1)取0.5g左右裙边组织，用超纯水反复冲洗组织表面的无水乙醇，经充分剪碎后放入1.5mL的离心管中；(2)向离心管中加入10～15μL的蛋白酶K和500μL的HOMbuffer，55℃消化4～6h；(3)加入500μL4.5MNaCL溶液和300μL的氯仿，充分混匀20min以后，在13000rpm下离心10min；(4)将上清液转移到另一个灭菌的新管中，加入600μL无水异丙醇，充分摇匀2...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁宏伟，邹桂伟，王利华，沙航，孟彦，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院长江水产研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42