一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法技术

本发明专利技术提供了一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，所述纯化方法适用于肉兔、獭兔、长毛兔、观赏兔等各类比利时毛色家兔的纯化。本发明专利技术所述方法为：首先挑选出毛色表型为比利时毛色的家兔；随后使用第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的家兔。本发明专利技术所述纯化方法得到基因型AAEECC的家兔为比利时毛色纯合子，剔除了隐性白基因。利用本发明专利技术所述纯化方法培育的比利时毛色家兔专门化品系，在保证商品代兔毛色一致的基础上，能够很好地保护育种企业的种质材料。

Purification of Belgian Fur Rabbit Based on Genotype Selection

The invention provides a purification method for Belgian fur rabbits based on genotype selection, which is suitable for the purification of meat rabbits, Rex rabbits, long hair rabbits, ornamental rabbits and other Belgian fur rabbits. The method of the invention is as follows: firstly, the rabbits with Belgian fur color phenotype are selected; secondly, the first primer group, the second primer group and the third primer group are used to detect ASIP gene, MC1R gene and TYR gene, and then the rabbits with AA (corresponding ASIP gene), EE (corresponding MC1R gene) and C C (corresponding TYR gene) are screened. The purified method of the invention obtains that the rabbit of genotype AAEECC is a Belgian coat homozygote, and the recessive white gene is eliminated. The specialized strain of Belgian fur rabbit bred by the purification method of the invention can protect germplasm materials of breeding enterprises well on the basis of ensuring uniform fur color of commercial rabbits.

【技术实现步骤摘要】
一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法
本专利技术属于家畜育种
，具体涉及一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法。
技术介绍
比利时兔毛色属野生类型，被毛深红带黄褐色或红褐色，整根毛的两端深、中间较浅，质地坚韧，紧贴体表。其头、颈、背、体侧、四肢外侧毛纤维均与野兔毛纤维颜色相似，毛纤维的基部为浅灰色，中段色稍淡，毛尖颜色深，并夹杂有黑色枪毛。下颌、颈下、四肢内侧、腹部、尾之腹面毛色较浅。皮肤除腹部、四肢内侧、颌下为褐黄色外，其他部位为深灰色，毛色光亮。比利时兔毛色有天然光泽，被毛皮张大、皮板柔性和弹性好，备受毛皮市场青睐。比利时毛色不仅可以作为容易识别的家兔品种特征，而且有特定的经济价值、社会需求和市场偏好。家兔毛色受多个基因控制，这些基因间呈现复杂的显隐性和上位互作关系，生产实践中比利时毛色家兔的遗传背景比较复杂，很少有毛色纯合的种群，利用常规育种方法进行毛色纯化不仅费时费力，而且往往不够彻底。大多数比利时毛色家兔种群中携带隐性白基因，后代常出现白色个体，在利用比利时毛色家兔品系与白兔品系杂交生产中，这一问题尤为突出。在家兔纯繁和杂交生产中，由于我们无法控制家兔繁殖过程中的毛色基因分离和重组，因此要获得毛色一致的后代，必须通过对毛色基因型的育种设计，事先选育出特定基因型的纯合子亲本种群。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法。本专利技术所述方法为：首先挑选出毛色表型为比利时毛色的家兔；随后使用第一引物组、第二引物组和第三引物组，同时对ASIP基因、MC1R基因和TYR基因进行检测，筛选出基因型为AA(对应ASIP基因)、EE(对应MC1R基因)和CC(对应TYR基因)的比利时毛色兔。本专利技术所采用的技术方案为：本专利技术中，使用到的基因包括ASIP基因、MC1R基因和TYR基因。ASIP基因，即通常所说的Agouti基因，中文为“刺豚鼠毛色基因”或“鼠灰色基因”，其结构复杂，不是单一位点，而是一个含有许多等位基因的位点，由4个外显子和3个内含子组成。外显子2、3和4为编码序列，外显子1为非编码序列。ASIP基因编码一种旁分泌信号分子，即Agouti信号蛋白(ASIP)，使毛囊黑色素细胞合成棕黑素。此外ASIP基因还编码一种Agouti基因相关蛋白，与ASIP共同调节毛色。黑素皮质素受体1(melanocortin1-receptor，MC1R)基因在控制黑色素形成过程中起重要作用，MC1R为G蛋白耦合的受体黑色素皮质素受体家族之一，是其家族成员中最小的一个受体，编码蛋白主要作用于黑色素细胞，与a-MSH(alphamelnocytestimulatinghormonereceptor)结合提高环腺苷酸水平，形成真黑色素。家兔不同的MC1R基因型对应不同的毛色。ASIP和MC1R是哺乳动物体内调控毛色的两个重要候选基因，ASIP的表达会引起褐黑素的产生，MC1R的表达会引起真黑素的产生，通过调节真黑素和褐黑素的比例来影响毛色。酪氨酸酶(TYR)基因位于常染色体上，正常的TYR基因控制的性状是有色毛，当TYR基因中第1119位点的碱基由“C”突变为“A”时，为隐性白基因型。根据本专利技术的用于纯合比利时毛色兔的引物组，如SEQIDNO：1和SEQIDNO：2所示，所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。一种基于分子辅助选择的比利时毛色兔纯化方法，所述纯化方法包括以下步骤：(1)提取待鉴定家兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；(2)根据步骤(1)得到的所述扩增产物，鉴别待鉴定家兔的基因型，筛选得到表型为比利时毛色的纯合型家兔。进一步的，步骤(1)中，所述待鉴定家兔为肉兔、獭兔、长毛兔或观赏兔等类型中的任一种。进一步的，步骤(1)中，所述待鉴定家兔毛色表型为比利时毛色。进一步的，步骤(1)中，所述第一引物组的正向引物为5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’，反向引物为5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’进一步的，步骤(1)中，所述第二引物组的正向引物为5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’，反向引物为5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’。进一步的，步骤(1)中，所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。进一步的，步骤(1)中，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl225mM、dNTPs0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、TaqDNA聚合酶2.5U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。进一步的，步骤(1)中，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO48.0mM、MgCl21.5mM、TWEEN-200.05％、dNTPs0.2mM、正向引物和反向引物各3.3ng/μl、TaqDNA聚合酶2.0U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性2min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在62℃下退火45s，在72℃温度下延伸60s；完成30个循环之后，在72℃延伸8min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。进一步的，步骤(1)中，使用所述第三引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl225mM、dNTPs0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、TaqDNA聚合酶2.5U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。进一步的，步骤(1)中，使用苯酚-氯仿抽提法或CTAB法提取待鉴定家兔的基因组DNA。进一步的，步骤(2)中，鉴别的方法为：对使用所述第一引物组得到的扩增产物进行测序，检测ASIP基因第二外显子的第5位点和第6位点间插入碱基“A”时，记为a基因型，未插入碱基“A”时，记为A基因型；对使用所述第二引物组得到的扩增产物进行测序，检测MC1R基因第280-285位点的碱基无缺失且304-333位点的碱基缺失30bp，为E基因型；对使用所述第三引物组得到的扩增产物进行测序，检测TYR基因第四外显子的第1119位点的碱基类型，当碱基为“C”时，未发生基因突变，记为C基因型，当碱基为“A”时，发生基因突变，记为c基因型。进一步的，步骤(2)中，筛选得到基因型为AACCEE的纯合比利时兔毛色兔在育种中的应用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：(1)提取待鉴定家兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；(2)根据步骤(1)得到的所述扩增产物，鉴别待鉴定家兔的基因型，筛选得到表型为比利时毛色的纯合型家兔。

【技术特征摘要】
1.一种基于基因型选择的比利时毛色家兔纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括以下步骤：(1)提取待鉴定家兔的基因组DNA，分别使用所述第一引物组、第二引物组和第三引物组进行扩增，得到扩增产物；(2)根据步骤(1)得到的所述扩增产物，鉴别待鉴定家兔的基因型，筛选得到表型为比利时毛色的纯合型家兔。2.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待鉴定家兔为肉兔、獭兔、长毛兔或观赏兔等类型中的任一种。3.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待鉴定家兔毛色表型为比利时毛色。4.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一引物组的正向引物为5’-AAGAAAGCAGGAAGGCACA-3’，反向引物为5’-CAAGGCAGGATTGGCTCA-3’；所述第二引物组的正向引物为5’-ACCTGCTGGTGAGCGTGA-3’，反向引物为5’-GTAGCGCAGTGCGTAGAAGA-3’；所述第三引物组的正向引物为5’-AAGACAAGGTGAAAGG-3’，反向引物为5’-TAAATCCAATAGGCAC-3’。5.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，使用所述第一引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、MgCl225mM、dNTPs0.2mM、正向引物和反向引物各5ng/μl、TaqDNA聚合酶2.5U和模版DNA50ng；扩增程序为：在94℃温度下预变性5min；然后进行30个循环，其中每个循环依次包括以下步骤：在94℃温度下变性45s，在52℃下退火45s，在72℃温度下延伸30s；完成30个循环之后，在72℃延伸5min，即完成PCR扩增程序并在4℃下保存。6.根据权利要求1所述的纯化方法，其特征在于，步骤(1)中，使用所述第二引物组扩增时，扩增体系为：总体积为20μL，包括Tris-HCL33.5mM、(NH4)2SO48.0mM、Mg...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊新忠，乔西波，惠春晖，王波，杨爱国，胡家卿，李明勇，
申请(专利权)人：山东农业大学，
类型：发明
国别省市：山东,37