一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法技术

本发明专利技术提供一种肉与肉制品中猪源性成分实时荧光检测方法。该方法可检测扩增过程中的荧光信号，不需要普通PCR检测方法所用的电泳，节省检测时间，实时观察检测结果。同时在检测过程中加入扩增内标、阳性对照来避免检测结果假阴性，加入阴性对照、空白对照来避免检测结果假阳性，从多个方面来保障检测结果的准确性。该技术对于提高动物源性食品安全监管水平，确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都具有积极作用。

A real-time quantitative PCR method for detection of pig origin components in meat or meat products

The invention provides a real-time fluorescence detection method for pig origin components in meat and meat products. This method can detect the fluorescence signal in the amplification process without the electrophoresis used in the ordinary PCR detection method. It saves the detection time and observes the detection results in real time. At the same time, in order to avoid false negative test results, the internal standard of amplification and positive control are added in the detection process, and the negative control and blank control are added to avoid false positive test results, so as to ensure the accuracy of test results from many aspects. This technology plays an active role in improving the supervision level of animal-derived food safety, ensuring food quality and safety, guaranteeing the health and quality of life of the broad masses of the people, maintaining social stability and economic development.

【技术实现步骤摘要】
一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法
本专利技术属于生物技术检测领域，涉及肉或肉制品中动物源性成分的检测方法，特别是肉或肉制品中猪源性成分的检测方法。
技术介绍
随着我国经济的快速发展，动物源性商品的消费量在不断增加，经常会遇到不法商家为追逐经济利益在食品加工过程中对动物源性原料以次充好、掺杂使假等欺诈甚至违法行为。因此，建立一种快速、准确的动物源性成分鉴别的方法对于提高动物源性食品安全监管水平，确保食品质量安全，保障广大人民群众的身体健康和生活质量，维护社会稳定和经济发展都具有积极作用。在肉制品加工过程中会加入各种原料，采用各种方法加工，在这些过程中会产生很多抑制PCR反应的物质，从而导致假阴性的产生。另外由于反应体系中存在抑制剂，PCR仪器故障，反应体系错误，聚合酶失活等原因也会造成的假阴性结果。本专利技术在检测体系中加入了人工构建的扩增内标(internalamplificationcontrol，IAC)，IAC是添加到PCR反应体系中和目标基因非同源的但可以同时扩增的一段人工构建的DNA序列，可以用来指示假阴性现象。如果反应体系中加入扩增内标，无论在反应体系中有无目标基因出现，扩增内标的信号总会出现，如果扩增内标无信号说明PCR反应失败，因此加入IAC可以有效的解决假阴性的现象。在DNA提取的过程中由于操作失误造成的DNA的丢失，也会造成结果的假阴性，为了解决这一问题，本专利技术在检测猪源性成分的同时另外增加一对引物，检测提取的DNA是否丢失，该引物能够扩增所有脊椎动物的DNA样品，只要能提取到DNA，该引物就能扩增出PCR产物，避免了提过过程中DNA的丢失。另外由于操作的失误可能造成样品之间的污染，DNA、PCR产物气溶胶污染等，这些污染可能造成检测结果假阳性，因此在本专利技术在PCR检测的过程中设置了阴性对照，空白对照。阴性对照扩增模板DNA来源于非猪源性成分的样品，用来提示是否存在样品污染。空白对照为PCR检测体系中不加模板DNA，用来提示是否存在DNA、PCR产物气溶胶污染。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对肉与肉制品中猪源性成分PCR检测假阳性、假阴性结果现象，提供一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，具体步骤如下：(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。1.其中肉或肉制品指的是猪肉，牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉中的一种或多种的混合。2.采用的基因组DNA的提取方法为常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。3.提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA的同时还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知非猪肉或肉制品(牛肉，羊肉，鸡肉，鸭肉，鹅肉，兔肉，驴肉，马肉，鹿肉，牦牛肉，狗肉，鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。4.实时荧光定量PCR检测方法所用的引物和探针如下：猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQIDNO1和SEQIDNO2，探针为SEQIDNO3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQIDNO1和SEQIDNO2，探针为SEQIDNO4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQIDNO5和SEQIDNO6，探针为SEQIDNO7，5′端CY5标记，3′端BHQ1标记；在脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQIDNO5和SEQIDNO6，探针为SEQIDNO4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。5.每个样品同时进行2种荧光定量PCR反应体系，反应体系如下：第一种为猪源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL-1)2.5μL，引物SEQIDNO1和SEQIDNO2(10μmol·L-1)各0.5μL，探针SEQIDNO3和SEQIDNO4(10μmol·L-1)0.5μL，RoxReferenceDyeII0.5μL，PremixExTaq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。第二种为脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-COM-CDV(20ng·μL-1)2.5μL，引物SEQIDNO5和SEQIDNO6(10μmol·L-1)各0.5μL，探针SEQIDNO7和SEQIDNO4(10μmol·L-1)0.5μL，RoxReferenceDyeII0.5μL，PremixExTaq(2×)12.5μL，补水至25μL。反应程序：预变性95℃，30s；变性95℃，5s；退火65℃，34s；重复40个循环。6.除待检样品外还要设置非猪源性DNA的阴性对照(已知非猪肉或肉制品中提取的DNA)，无模板的空白对照，标准猪源性成分DNA的阳性对照(已知纯猪肉或肉制品中提取的DNA)。7.结果的判断标准如下：a.非猪源性DNA阴性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。b.空白对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测无JOE荧光信号，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测无CY5荧光信号检出，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。c.标准猪源性成分阳性对照：第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测JOE荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35；第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。d.待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测FAM荧光信号检出且Ct值＜35，第二种脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测CY5荧光信号检出且Ct值＜35，FAM荧光信号检出且Ct值＜35。在a-d满足上述结果的前提下判断待检样品中有无猪源性成分，待检样品第一种猪源性成分实时荧光定量PCR检测中如果没有JOE荧光信号说明没有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出且Ct值＜35说明含有猪源性成分；如果JOE荧光信号检出但Ct值≥35视为没有猪源性成分。如果a-d不满足上述结果时，应重新进行检测。本专利技术提供一种肉与肉制品中猪源性成分实时荧光检测方法。该方法可检测扩增过程中的荧光信号，不需要普通PCR检测方法所用的电泳，节省检测时间，实时观察检测结果。同时在检测过程中加入扩增内标、阳性对照来避免检测结果假阴性，加入阴性对照、空白对照来避免检测结果假阳性，从多个方面来保障检测结果的准确性。该技术对于提高本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。

【技术特征摘要】
1.一种肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于包括以下步骤：(1)肉或肉制品中基因组DNA的提取；(2)以肉或肉制品中提取的基因组DNA作为模板，进行实时荧光定量PCR反应；(3)根据荧光信号判断肉或肉制品中是否含有猪源性成分。2.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品为猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉中的一种或多种的混合。3.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取方法可采用常规的蛋白酶K消化，苯酚抽提，乙醇沉淀的方法或商品化DNA提取试剂盒或其他相似的方法。4.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(1)中所述的肉或肉制品中基因组DNA的提取时除提取待检测肉或肉制品中的基因组DNA以外，还需要提取已知纯猪肉或肉制品和已知非猪肉或肉制品(牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鹅肉、兔肉、驴肉、马肉、鹿肉、牦牛肉、狗肉、鱼肉的一种或多种的混合)作为对照样品。5.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中所用的引物和探针如下：猪源性成分实时荧光定量PCR检测所用引物为SEQIDNO1和SEQIDNO2，探针为SEQIDNO3，5′端JOE标记，3′端BHQ1标记；在猪源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQIDNO1和SEQIDNO2，探针为SEQIDNO4，5′端FAM标记，3′端BHQ1标记。脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR检测所用通用引物为SEQIDNO5和SEQIDNO6，探针为SEQIDNO7，5′端CY5标记，3′端BHQ1标记；在脊椎动物源性成分实时荧光定量PCR反应体系中扩增内标所用引物SEQIDNO5和SEQIDNO6，探针为SEQIDNO4。6.如权利要求1所述肉或肉制品中猪源性成分实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于步骤(2)中每个样品同时进行2种荧光定量PCR反应体系第一种为猪源性成分实时荧光定量PCR检测，25μL反应体系：肉或肉制品中提取的基因组DNA模板(200ng·μL-1)2.5μL，扩增内标质粒pMD18-T-SUS-CDV(20ng·μL-1)2.5μL，引物SEQIDNO1和SEQIDNO2(10μmol·L-1)各0.5μL，探针SEQIDNO3和SEQIDNO4(10μmol·L-1)0.5μL，RoxReferenceDyeII0.5μL，Pre...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚大伟，杨德吉，周光宏，孙昭宇，徐幸莲，叶可萍，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32