基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法技术

本发明专利技术涉及基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，通过研究奶牛在受孕前后的整合素αvβ3表达变化规律，探究其与奶牛早期妊娠的关系，筛选影响早期妊娠的因子，从而研发奶牛早期孕检的检测试剂盒。本发明专利技术提供的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，将奶牛的妊娠检测窗口提前到输精后的第16天，比目前常用方法提前了12天，可有效降低奶牛养殖业的繁殖成本，提高奶牛行业中母牛的利用效率，增加经济收入。

A Method for Determining the Success of Artificial Fertilization of Dairy Cows Based on the Expression of Integrin

The invention relates to a method for judging the success of artificial fertilization of dairy cows based on the expression of integrin. By studying the regularity of integrin alpha v beta 3 expression before and after conception, the relationship between integrin alpha v beta 3 expression and early pregnancy of dairy cows is explored, and the factors affecting early pregnancy are screened, so as to develop a test kit for early pregnancy detection of dairy cows. The method for judging the success of artificial insemination of dairy cows based on the expression of integrin provided by the invention advances the pregnancy detection window of dairy cows to the 16th day after insemination, 12 days ahead of the current commonly used method, which can effectively reduce the reproductive cost of dairy cow breeding industry, improve the utilization efficiency of cows in the dairy industry and increase economic income.

【技术实现步骤摘要】
基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法
本专利技术涉及分子生物学及遗传育种
，具体涉及一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法。
技术介绍
配种效率的高低对牧场的奶牛生产有着直接影响，输精后一段时间后对奶牛进行早期妊娠诊断，如果存在相关技术那么这段时间越早就越可以提前区分奶牛是否妊娠，从而可以提前对妊娠奶牛进行必要的保胎措施，并对未受孕的奶牛采取二次输精，将屡配不孕奶牛淘汰。目前孕期奶牛的成本主要包括饲料和人工，按照每头牛每天25元，每提前一天检测出一头奶牛受孕失败则养殖场将避免不必要支出25元，进而提高奶牛养殖场的经济收入。众多妊娠检测中常见的有直肠触诊法、超声波检查法等临床诊断法和孕酮、早期妊娠因子等免疫诊断方法。以上检测方法在检测对象、检测成本、操作难度和对检测对象的伤害等方面表现各不相同，但就检测窗口的时间而言最早在输精后第28天。牛胚胎着床过程中子宫容受态建立发生在输精后第10到第20天，整合素αvβ3有可能在这段时间发生mRNA水平表达量的变化。如果将受孕率与整合素αvβ3在mRNA水平表达量建立联系，这一联系有可能成为把奶牛早期妊娠的检测窗口提前到第10-18天的理论基础。整合素αvβ3是一种异二聚体的跨膜糖蛋白，主要功能是结合配体介导细胞之间、细胞与胞外间质之间的相互作用，研究发现其在奶牛早期妊娠中有重要作用。在胚胎着床过程相关研究证明整合素αvβ3参与了子宫内膜容受态的建立。目前在人的临床中提出整合素αvβ3与其配体的检测对子宫的容受态和非容受态进行鉴别。子宫容受态的建立与否是妊娠成功的重要影响因素，妊娠失败多发生在该阶段。因此在该阶段进行妊娠成功的检测十分有意义，可检测出多数妊娠失败。
技术实现思路
为将奶牛受孕检测时间提前，降低牛场成本，本专利技术提供了一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，包括如下步骤：步骤S1：于奶牛人工受精后的20天内，每天定期提取人工输精后的奶牛的血液，或者，仅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；步骤S2：从上述血液中提取DNA；步骤S3：设计αv基因引物和β3基因引物；步骤S4：利用步骤S3所设计的引物，对步骤S2中提取到的DNA进行PCR扩增；步骤S5：对扩增后的DNA进行αv基因和β3基因的相对表达量的测定以及αv基因和β3基因蛋白质的表达水平的测定，根据测定结果判断奶牛是否成功受孕；其中，步骤S5的判断原则包括：若第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若αv基因相对表达量变化不大，则奶牛未成功受孕。其中，所述步骤S5中的判断原则还包括：若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量无明显变化，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量几乎没有，则奶牛未成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其β3基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其β3基因相对表达量几乎没有，则奶牛未成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，有明显提高，则奶牛成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平几乎没有，则奶牛未成功受孕。其中，所述步骤S2中，提取的DNA的方法包括：步骤S21，匀浆处理：取1mL冻存牛全血，加入3mL红细胞裂解液混合，室温静置10分钟，10000rpm离心1分钟，吸弃上清，收集红细胞沉淀；步骤S22，分层：向收集的红细胞沉淀中加入500uLTrizol溶液，室温静置5分钟使红细胞沉淀充分溶解，再加入200uL氯仿摇匀后室温静置3分钟；步骤S23，沉淀RNA：将步骤S22最后所得样品12000rpm下离心10分钟后，获得分三层样品，转移最上层的水相并向转移后的最上层的水相中加入400uL冰乙醇，室温静置10分钟，之后4摄氏度下12000rpm离心10分钟，取管底沉淀物即RNA；步骤S24，漂洗RNA沉淀：向步骤S23所得RNA沉淀物中加入75％的乙醇溶液，震荡悬浮，后4摄氏度下6000rpm离心1分钟，吸弃上清，将沉淀室温晾干；步骤S25：向步骤S24得到的RNA沉淀中加入50uL无酶无菌水溶液溶解RNA沉淀；步骤S26：溶解后的RNA进行反转录合成DNA。其中，所述步骤S26中，RNA反转录合成DNA的反转录体系包括：1ug体积RNA、1uL核苷酸链引物、4uL反转录酶缓冲液、2uL脱氧核苷酸混合物、1uL反转录酶、1uL重组RNA抑制剂以及余量的无核酸酶处理水，反转录体系的总体积为20uL。其中，所述步骤S3中，所设计的αv基因引物包括：αv基因上游引物αv-F：15859caagagcagcgaggactttg，以及αv基因下游引物αv-R：gccgataaacacatatgcgt；所设计的β3基因引物包括：β3基因上游引物β3-F：tggggctgatgactgagagaag，以及β3基因下游引物β3-R：acgcacttccagctctat。其中，所述步骤S4中，PCR扩增的条件包括：步骤S41：95摄氏度下预变性10分钟；步骤S42：95摄氏度下变形10秒、59摄氏度下退火30秒以及72摄氏度下延伸32秒，一共进行40个循环；步骤S43：95摄氏度下延伸15秒、60摄氏度下延伸1分钟、95摄氏度下延伸15秒、60摄氏度下延伸15秒。本专利技术提供的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，将奶牛的妊娠检测窗口提前到输精后的第16天，比目前常用方法提前了12天，可有效降低奶牛养殖业的繁殖成本，提高奶牛行业中母牛的利用效率，增加经济收入。附图说明图1：受孕奶牛在不同时间其αv基因相对表达量。图2：未受孕奶牛在不同时间其αv基因相对表达量。图3：受孕奶牛在不同时间其β3基因相对表达量。图4：未受孕奶牛在不同时间其β3基因相对表达量。图5：受孕奶牛和未受孕奶牛在不同时间其αv基因及β3基因的蛋白质表达水平。具体实施方式为了对本专利技术的技术方案及有益效果有更进一步的了解，下面结合附图详细说明本专利技术的技术方案及其产生的有益效果。本专利技术通过研究奶牛在受孕前后的整合素αvβ3表达变化规律，探究其与奶牛早期妊娠的关系，筛选影响早期妊娠的因子，从而研发奶牛早期孕检的检测试剂盒。一、样品选取与采血方法选择一标准化奶牛场，选取10头雌性奶牛，要求为：2015年出生，体重相似，无生殖疾病及其他疾病，本次受孕均为第二胎，采取同期发情，输精日期为同一天，并在输精后继续观察记录确定是否受孕。准备10只5mL注射器并更换9号针头、若干酒精棉球、10只紫头10mL抗凝管。填料、上夹、保定牛头，左手握住牛尾本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：于奶牛人工受精后的20天内，每天定期提取人工输精后的奶牛的血液，或者，仅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；步骤S2：从上述血液中提取DNA；步骤S3：设计αv基因引物和β3基因引物；步骤S4：利用步骤S3所设计的引物，对步骤S2中提取到的DNA进行PCR扩增；步骤S5：对扩增后的DNA进行αv基因和β3基因的相对表达量的测定以及αv基因和β3基因蛋白质的表达水平的测定，根据测定结果判断奶牛是否成功受孕；其中，步骤S5的判断原则包括：若第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若αv基因相对表达量变化不大，则奶牛未成功受孕。

【技术特征摘要】
1.一种基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤S1：于奶牛人工受精后的20天内，每天定期提取人工输精后的奶牛的血液，或者，仅提取受精后第10天、第13天、第16天及第19天的血液；步骤S2：从上述血液中提取DNA；步骤S3：设计αv基因引物和β3基因引物；步骤S4：利用步骤S3所设计的引物，对步骤S2中提取到的DNA进行PCR扩增；步骤S5：对扩增后的DNA进行αv基因和β3基因的相对表达量的测定以及αv基因和β3基因蛋白质的表达水平的测定，根据测定结果判断奶牛是否成功受孕；其中，步骤S5的判断原则包括：若第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若αv基因相对表达量变化不大，则奶牛未成功受孕。2.如权利要求1所述的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于，所述步骤S5中的判断原则还包括：若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量无明显变化，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因相对表达量几乎没有，则奶牛未成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其β3基因相对表达量有明显提高，则奶牛成功受孕，若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA相比第13天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其β3基因相对表达量几乎没有，则奶牛未成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，有明显提高，则奶牛成功受孕；若第16天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平，相比第10天的奶牛血液对应的扩增后的DNA，其αv基因或β3基因的蛋白质表达水平几乎没有，则奶牛未成功受孕。3.如权利要求1所述的基于整合素的表达判断奶牛人工受精成功与否的方法，其特征在于：所述步骤S2中，提取的DNA的方法包括：步骤S21，匀浆处理：取1mL冻存牛全血...

【专利技术属性】
技术研发人员：麻柱，郭勇，王彦平，王相国，刘林，李艳华，吕小青，
申请(专利权)人：北京奶牛中心，北京农学院，
类型：发明
国别省市：北京,11