一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，具体步骤如下：取储存的人源皮肤；清除皮下附带脂肪成分；用碘伏及酒精清洗消毒，后用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；用Dispase II溶液处理过夜；去除表皮，后用生理盐水清洗，获得真皮；用高渗盐溶液处理；用生理盐水清洗；用脱细胞液在透析装置中处理，获得脱细胞真皮基质；用生理盐水清洗，得到人源的脱细胞真皮基质。本发明专利技术的制备方法简便，生产工艺简单可靠，提高生产效率，节约生产成本，可以最大程度减轻环境污染，同时获得的脱细胞真皮基质保留了皮肤基底膜，更利于细胞黏附增殖，同时脱细胞真皮含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持细胞的生长。

Preparation of human acellular dermal matrix

The invention discloses a preparation method of human acellular dermal matrix, which comprises the following steps: taking stored human skin; removing subcutaneous fat components; cleaning and disinfecting with Iodophor and alcohol, then repeatedly soaking and cleaning skin with hypoosmotic solution; treating skin with Dispase II solution overnight; removing epidermis, cleaning with normal saline, and obtaining dermis; and treating skin with hyperosmotic saline solution. Acellular dermal matrix was obtained by washing with normal saline, treating with acellular fluid in dialysis device, and human acellular dermal matrix was obtained by washing with normal saline. The preparation method of the present invention is simple, the production process is simple and reliable, the production efficiency is improved, the production cost is saved, and the environmental pollution can be minimized. At the same time, the acellular dermal matrix obtained retains the skin basement membrane and is more conducive to cell adhesion and proliferation. At the same time, the acellular dermis contains abundant growth factors, has good biocompatibility, and is more conducive to supporting cell growth. Long.

【技术实现步骤摘要】
一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法
本专利技术涉及医疗材料
，更具体的说是涉及一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法。
技术介绍
真皮替代物在创面愈合过程中具有重要作用，能够在创面底部提供真皮支架，提高培养表皮膜片的成活率，减小创面收缩和瘢痕形成。对于大面积烧伤或者创伤的病人来说，皮肤移植是最好的治疗方法。脱细胞真皮基质(ADM)具有与皮肤真皮近似的内在结构，作为真皮替代物在国内外实验、临床中均得到应用。目前脱细胞真皮基质主要分为两类：异体脱细胞真皮基质和异种的脱细胞真皮基质。相比异种的脱细胞真皮基质，实践和临床的使用证实，来源于人的尸体皮制作的同种异体脱细胞真皮作为真皮替代物最为理想，其机械性能与正常皮肤接近，组织相容性较好，免疫排斥反应较小，更适合皮肤缺损的修复。脱细胞真皮基质制备的目的是尽可能的去除皮肤组织中的细胞成分(包括表皮细胞、毛囊、皮脂腺、汗腺及真皮中的血管内皮细胞、成纤维细胞等)，尽可能保留细胞外基质成分以及真皮组织完整的三维结构。这样能提供引导组织再生的生物支架，达到最大限度修复组织缺损的目的。虽然目前脱细胞真皮基质制备方法很多，但都或多或少存在一定问题：目前脱细胞真皮基质的制备方法均十分繁杂，需要酶消化，碱液处理等，步骤繁复，工艺复杂，大大增加了生产成本；目前脱细胞真皮基质的制备方法中大部分均使用了化学固定剂，如戊二醛等，这大大改变了脱细胞真皮基质的天然结构，并阻碍了脱细胞真皮基质在生物体内的降解；同时戊二醛残留造成了脱细胞产品较大的细胞和遗传毒性，极大地影响临床使用；目前也有很多的脱细胞真皮基质制备方法引入了碱溶液及有机溶剂处理，这不仅影响脱细胞真皮基质的结构，同时也加大了环境污染的可能性，废液的处理也增加了成本；如反复冻融法，此方法属于利用物理方法进行脱细胞处理，时间久、周期长，现在基本己经不用。因此，提供一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，保证获得的脱细胞真皮基质细胞毒性低、遗传毒性低，生物相容性高，获得的脱细胞真皮基质主要用于皮肤及黏膜缺损的修复。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，具体步骤如下：(1)取储存的人源皮肤；(2)清除皮下附带脂肪成分；(3)将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用碘伏及酒精清洗消毒，后用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；(4)将步骤(3)清洗后的皮肤用2.5mg/mlDispaseII溶液处理过夜；(5)弃去DispaseII溶液，去除表皮，后用生理盐水清洗，获得真皮；(6)将步骤(5)获得的真皮用含有Ca2+的高渗盐溶液处理12-24h；(7)弃去高渗盐溶液后，用生理盐水清洗；(8)将步骤(7)清洗后的真皮置于配制好的“脱细胞液”中，在“透析装置”中处理2h-6h，获得脱细胞真皮基质；(9)将步骤(8)获得的脱细胞真皮基质用生理盐水清洗3次，每次15min，得到人源的脱细胞真皮基质。进一步，步骤(3)，将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用2％碘伏清洗消毒，用75％酒精脱碘，再用无菌蒸馏水反复浸泡清洗皮肤。进一步，步骤(6)，将步骤(5)获得的真皮用0.5-3mol/L含有Ca2+的高渗盐溶液处理12-24h，Ca2+的终浓度为1-10mM/L。进一步，所述高渗盐溶液为0.5-3mol/L含有Ca2+的氯化钠溶液，Ca2+的终浓度为1-10mM/L。进一步，步骤(8)所述的“脱细胞液”包含以下组分：0.1％-0.5wt％胰酶，0.5-5mMEDTA，0.1％-0.5wt％TritonX-100，Na+0.1-0.5mol/L，Cl-0.1-0.5mol/L，Ca2+1-10mmol/L；Ca2+来自Ca(NO3)2，NO3-2-20mmol/L。进一步，步骤(8)所述的“脱细胞液”包含以下组分：0.1％-0.5wt％胰酶，0.5-5mMEDTA，0.1％-0.5wt％TritonX-100，Na+0.1-0.5mol/L，Cl-0.1-0.6mol/L，Ca2+1-10mmol/L；Ca2+来自CaCl2。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，本专利技术的脱细胞真皮基质来源于人体皮肤，具有与皮肤真皮近似的内在结构，作为真皮替代物在国内外实验、临床中均得到应用；人体皮肤经脱细胞处理后免疫排斥反应极小，机械性能与正常皮肤接近，能获得满意的修复效果，在医学领域具有较高的实际应用价值；本专利技术利用新型的“脱细胞液”，包含有Ca2+、去污剂、NaCl等成分，在脱去细胞的同时最大程度保持真皮结构不变化；Ca2+作为一种细胞培养必须离子，在合适浓度下不仅能够稳定脱细胞真皮基质的结构，还能在脱细胞处理过程中增强材料的机械、理化性能、生物相容性、止血性能等作用；同时创新性的引入“透析装置”，在脱细胞的同时将有害的脱细胞试剂去除，保证产品的低细胞毒性、低遗传毒性，高生物相容性；本专利技术采用的试剂价廉易得，无毒无害，在杀灭细菌、病毒等病原体的同时最大程度地脱去细胞，保留细胞基质成分，获得的产品免疫免疫排斥反应极小；本专利技术制备方法简便，生产工艺简单可靠，提高生产效率，节约生产成本，采用本专利技术提供的方法可以最大程度减轻环境污染，同时获得的脱细胞真皮基质保留了皮肤基底膜，更利于细胞黏附增殖，同时脱细胞真皮含有丰富的生长因子，具有良好的生物相容性，更有利于支持细胞的生长。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。图1附图为本专利技术的透析装置示意图；图2附图为本专利技术获得的脱细胞真皮基质的照片；图3附图为本专利技术脱细胞真皮基质内部结构的电镜照片；图4附图为本专利技术正常皮肤组织HE染色结果；图5附图为本专利技术脱细胞真皮基质HE染色结果；图6附图为本专利技术未使用脱细胞液、未采用透析装置制备的脱细胞真皮基质HE染色图；图7附图为本专利技术细胞增殖试验结果。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，具体步骤如下：(1)取储存的人源皮肤；(2)清除皮下附带脂肪成分；(3)将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用2％碘伏清洗消毒，用75％酒精脱碘，再用无菌蒸馏水反复浸泡清洗皮肤；(4)将步骤(3)清洗后的皮肤用2.5mg/mlDispaseII溶液处理过夜；(5)弃去DispaseII溶液，去除表皮，后用生理盐水清洗，获得真皮；(6)将步骤(5)获得的真皮用2mol/L含有Ca2+的氯化钠溶液处理18h，Ca2+的终浓度为5mM/L；(7)弃去2mol/L氯化钠溶液后，用生理盐水清洗；(8)将步骤(7)清洗后的真皮置于配本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)取储存的人源皮肤；(2)清除皮下附带脂肪成分；(3)将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用碘伏及酒精清洗消毒，后用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；(4)将步骤(3)清洗后的皮肤用2.5mg/ml Dispase II溶液处理过夜；(5)弃去Dispase II溶液，去除表皮，后用生理盐水清洗，获得真皮；(6)将步骤(5)获得的真皮用含有Ca

【技术特征摘要】
1.一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)取储存的人源皮肤；(2)清除皮下附带脂肪成分；(3)将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用碘伏及酒精清洗消毒，后用低渗溶液反复浸泡清洗皮肤；(4)将步骤(3)清洗后的皮肤用2.5mg/mlDispaseII溶液处理过夜；(5)弃去DispaseII溶液，去除表皮，后用生理盐水清洗，获得真皮；(6)将步骤(5)获得的真皮用含有Ca2+的高渗盐溶液处理12-24h；(7)弃去高渗盐溶液后，用生理盐水清洗；(8)将步骤(7)清洗后的真皮置于配制好的“脱细胞液”中，在“透析装置”中处理2h-6h，获得脱细胞真皮基质；(9)将步骤(8)获得的脱细胞真皮基质用生理盐水清洗3次，每次15min，得到人源的脱细胞真皮基质。2.根据权利要求1所述的一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)，将步骤(2)清除皮下附带脂肪成分的皮肤，用2％碘伏清洗消毒，用75％酒精脱碘，再用无菌蒸馏水反复浸泡清洗皮肤。3.根据权利要求1所述的一种人源的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)，将步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：董亚兵，朱宁文，朱迎春，
申请(专利权)人：上海仁康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31