非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法技术

本发明专利技术提供非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法，非病毒载体带正电，MicroRNA带负电，MicroRNA与非病毒载体以静电作用的方式相结合，通过混合静置的方式形成MicroRNA非病毒载体复合体，MicroRNA非病毒载体复合体再与骨粉进行混合，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料。本发明专利技术的有益效果是填补了临床上单独使用骨粉带来的缺陷，赋予骨粉骨生成性和诱导性，既可提高牙槽骨的成骨质量，又可缩短成骨时间。

Composite material of microRNA and bone powder delivered by non-viral vectors and its preparation method

The invention provides a composite material for delivering microRNA and bone meal by non-viral vectors and a preparation method thereof. The non-viral vectors are positively charged, the microRNA is negatively charged, and the microRNA and non-viral vectors are combined by electrostatic interaction to form a microRNA non-viral vector complex through a mixed static way. The microRNA non-viral vector complex is then mixed with bone meal to obtain a non-viral carrier. In vivo delivery of microRNA and bone powder composite materials. The invention has the beneficial effect of filling the defect caused by the clinical use of bone powder alone, endowing bone powder with bone formation and induction, improving the quality of alveolar bone osteogenesis and shortening the osteogenesis time.

【技术实现步骤摘要】
非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法
本专利技术涉及生物医用组织工程材料
，更具体地说涉及一种基于非病毒类载体投递microRNA并掺杂已经商用的骨粉促进牙槽骨快速愈合的方法。
技术介绍
针对牙列缺失或缺损，目前医学上多采用可摘义齿、烤瓷牙技术或牙齿种植术对牙列进行填补修复。可摘义齿适用范围广，便于自行摘戴，且费用相对较低，但稳定性较差，长期使用可能会造成基牙损伤，引发一系列口腔疾病；烤瓷牙美观坚固、耐磨抗折且生物相容性较好，但因其以邻近齿为受力依托，长时间使用会造成周边牙齿松动，故而口腔种植技术逐渐受到人们关注。但是有很大一部分患者因为牙槽骨骨量不足而不能及时甚至无法进行口腔种植。目前，临床上解决骨量不足的治疗手段主要有自体骨、同种异体骨、异种骨、人工骨替代材料或组织工程骨植入等。其中，自体骨移植作为传统的治疗手段，最大优势即不会产生免疫排斥反应，但因供体骨量有限，大量取材较为困难，且易造成二次创伤，高吸收、并发症较多。同种异体骨和异种骨移植手段我们需解决外源性抗原问题，尽量避免免疫排斥反应，降低二次疾病的风险。经查阅，骨粉有着与人体骨相似的钙磷比例，具有较为适宜的孔连接内径，有利于细胞的渗透与营养物的循环。因其具有的较高孔隙率和相互连通性，可促进位于腔隙中成骨细胞之间的胞间通讯，故而被视为骨传导的良好材料。但是骨粉作为无机支架材料，缺乏诱导成骨的活性因子，所以骨粉虽然具有优异的骨传导性但没有骨诱导和骨生成性。MicroRNA又称微小RNA，长度约为22个核苷酸，通过碱基配对方式结合到靶mRNA的3’非翻译区(3’UTR)，可以抑制其翻译，但不影响其转录。大量研究证实，miRNA在干细胞向成骨细胞分化和骨形成中扮演着重要的角色。但是MicroRNA在体内容易被酶降解，且本身含有磷酸根基团带负电性而不能主动进入细胞，进而难以发挥诱导成骨的作用。为使目的基因发挥其最大效用，我们需要选择合适的载体来进行投递。骨组织工程常用载体有两种：病毒载体及非病毒载体。非病毒载体包括脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒子投递系统等。投递microRNA的载体进入机体后，首先要通过排列较为致密的细胞外基质及各种纤维蛋白，该过程往往会阻碍载体向细胞内的递送，致使效率降低；到达靶细胞后，细胞以内吞的方式将非病毒载体转运至细胞内部，该过程需保持递送载体的活性，同时使其在胞内进行降解。非病毒载体安全性高，可设计性及可操作性强，对其进行修饰改造较易满足以上要求。脂质体是一种类脂类双分子层的球状囊泡结构，以脂类为主要成分，具有一定的生物可降解性及较好的生物相容性。脂质体用作基因载体有着二十余年的历史，最早使用脂质体递送RNA的是Felgner等人。他们开发了一种较为有效的RNA转染方法，使用合成的阳离子脂质——DOTMA与脂质体相混合，将带有荧光素酶的mRNA在体外转染进NIH3T3小鼠细胞中，观察荧光素酶在细胞中的表达情况。实验结果证实了该种方法可将RNA有效的转染进生物细胞中，且组织学检测结果表明基因在细胞中得到了较好的表达，转染进NIH3T3小鼠细胞后，加盖B8-球蛋白非翻译序列产生了多于对照组至少1000倍的荧光蛋白。无机纳米粒子投递系统包括金纳米粒子、介孔硅纳米粒子等。金纳米粒子具有生物惰性，毒性较低，易于进行修饰、合成和功能化。
技术实现思路
本专利技术克服了现有技术中的不足，提供了一种非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料及其制备方法，以骨粉作为支架材料，保持了多孔的天然骨无机结构，有着与人牙槽骨相似的物化结构和力学性能，且生物相容性较好，引入脂质体等非病毒载体包载的microRNA，将活性因子引入支架材料中，发挥骨诱导的作用，以填补单独使用骨粉带来的缺陷。本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料，非病毒载体带正电，MicroRNA带负电，MicroRNA与非病毒载体以静电作用的方式相结合，通过混合静置的方式形成MicroRNA非病毒载体复合体，MicroRNA非病毒载体复合体再与骨粉进行混合，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料。MicroRNA为MicroRNA-21、MicroRNA-29b或者MicroRNA-26a。非病毒载体采用能够投递microRNA的非病毒类载体，如脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒子等。MicroRNA溶液的浓度为15-25mmol/L。MicroRNA与非病毒载体的摩尔比为1：(0.5-5)。骨粉为具有占位及支架作用的骨粉，如Bio-oss骨粉，直径为0.25-1mm；骨粉与MicroRNA非病毒载体复合体溶液的体积比为(1-100)：1，优选(60—100)：1。非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料的制备方法，将MicroRNA(模拟物)(溶液)加入200-300μL的水中，取非病毒载体(溶液)加入200-300μL的水中，静置3-8min后，将非病毒载体溶液加入到microRNA模拟物溶液中，混匀后室温20-25℃下孵育15-30min，形成MicroRNA非病毒载体复合体溶液，将上述溶液逐滴加入到骨粉颗粒中混合均匀，滴加速率为3-5滴/min，真空低温冻干后，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料。水采用去氧无RNA酶的双蒸水。MicroRNA为MicroRNA-21、MicroRNA-29b或者MicroRNA-26a。非病毒载体采用能够投递microRNA的非病毒类载体，如脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒子等。MicroRNA溶液的浓度为15-25mmol/L。MicroRNA与非病毒载体的摩尔比为1：(0.5-5)。骨粉为具有占位及支架作用的骨粉，如Bio-oss骨粉，直径为0.25-1mm；骨粉与MicroRNA非病毒载体复合体溶液的体积比为(1-100)：1，优选(60—100)：1。真空低温冻干的时间为8—12h。本专利技术的有益效果为：与现有技术相比，本专利技术选用microRNA脂质体2000复合物与Bio-Oss骨粉相结合，填补了临床上单独使用骨粉带来的缺陷，赋予骨粉骨生成性和诱导性，既可提高牙槽骨的成骨质量，又可缩短成骨时间。附图说明图1是microRNA脂质体2000复合物的琼脂糖凝胶电泳分析图；图2是microRNA脂质体2000复合物及其与骨粉复合后的细胞毒性测试图；图3是用荧光显微镜观察的microRNA脂质体2000复合物转染图；图4是microRNA脂质体2000复合物与骨粉复合后刺激细胞后，钙钴法染色观察碱性磷酸酶活性图；图5是microCT观察体内microRNA脂质体2000复合物与骨粉复合材料促成骨图。具体实施方式下面通过具体的实施例对本专利技术的技术方案作进一步的说明，除非特殊说明，溶液即为水溶液，如MicroRNA模拟物溶液为MicroRNA模拟物水溶液。实施例中使用的药品为市购药品，MicroRNA-21、29b、26a，脂质体2000购自上海吉玛制药技术有限公司，骨粉为Bio-oss骨粉，购自瑞斯美口腔医疗器械(北京)有限公司。制备microRNA脂质体2000复合物与骨粉的复合材料，MicroRNA选用microRNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料，其特征在于：非病毒载体带正电，MicroRNA带负电，MicroRNA与非病毒载体以静电作用的方式相结合，通过混合静置的方式形成MicroRNA非病毒载体复合体，MicroRNA非病毒载体复合体再与骨粉进行混合，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料；其中，MicroRNA与非病毒载体的摩尔比为1：(0.5‑5)，骨粉与MicroRNA非病毒载体复合体溶液的体积比为(1‑100)：1。

【技术特征摘要】
1.非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料，其特征在于：非病毒载体带正电，MicroRNA带负电，MicroRNA与非病毒载体以静电作用的方式相结合，通过混合静置的方式形成MicroRNA非病毒载体复合体，MicroRNA非病毒载体复合体再与骨粉进行混合，得到非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料；其中，MicroRNA与非病毒载体的摩尔比为1：(0.5-5)，骨粉与MicroRNA非病毒载体复合体溶液的体积比为(1-100)：1。2.根据权利要求1所述的非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料，其特征在于：MicroRNA为MicroRNA-21、MicroRNA-29b或者MicroRNA-26a；非病毒载体采用能够投递microRNA的非病毒类载体，如脂质体、阳离子聚合物、无机纳米粒子等；骨粉为具有占位及支架作用的骨粉，如Bio-oss骨粉，直径为0.25-1mm。3.根据权利要求1所述的非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料，其特征在于：MicroRNA溶液的浓度为15-25mmol/L。4.非病毒类载体投递MicroRNA与骨粉的复合材料的制备方法，其特征在于：将MicroRNA模拟物加入水中形成microRNA模拟物溶液，取非病毒载体加入水中形成非病毒载体溶液，静置后将非病毒载体溶液加入到microRNA模拟物溶液中，混匀后在室温下孵育，形成MicroRNA非病毒载体复合体溶液，将上述溶液逐滴加入到骨粉颗粒中混合均匀，真空低温冻干后，得到非...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵瑾，李学平，原续波，侯信，战琦，李思迪，韩冬琳，李雪，孙晓雷，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12