含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物制造技术

本发明专利技术提出一种含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物。所述的关节软骨修复组合物，包含再生组织基质微粒和PRP，所述PRP为含有血小板浓度(1200～1600)×10

Composition of Articular Cartilage Repair Containing Regenerated Tissue Matrix Particles

The invention provides an articular cartilage repair composition containing regenerated tissue matrix particles. The articular cartilage repair composition comprises regenerated tissue matrix particles and PRP, and the PRP contains platelet concentration (1200-1600)*10.

【技术实现步骤摘要】
含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物
本专利技术属于再生医学领域，具体涉及一种再生组织基质微粒植入剂、及其制备方法和应用。
技术介绍
软骨缺损是临床上常见的疾病，致病原因包括各种创伤引起的软骨损伤以及以骨性关节炎为代表的软骨退行性病变等。软骨的再生能力弱，损伤后自我修复比较困难，故其治疗是目前相关学科比较关注的研究课题，其研究基本要素有种子细胞、支架材料以及培养系统三部分。而支架材料当中，可注射性支架材料因其创伤小、可塑性强而逐渐显示出其独特的优越性。软骨的细胞外基质主要由胶原和蛋白聚糖(PG)组成，作用是保护软骨细胞免受各种损伤。关节软骨胶原有5种，其中Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ型胶原是关节软骨特有的。Ⅱ型胶原组成胞外基质的基本骨架，占总胶原含量的90％～95％，直径20～300μm。Ⅱ型胶原网络保证关节软骨良好的延展性，抵抗剪切力。Ⅳ型胶原占软骨胶原总量的1％～2％，它在调节Ⅱ型胶原和蛋白聚糖功能方面起着重要作用。Ⅵ型胶原约占成熟关节软骨胶原含量的2％～3％，它可能与控制Ⅱ型胶原纤维的直径或生长有关。蛋白聚糖填塞于Ⅱ型胶原所构成的网状结构中，单体由一条核心蛋白与一至上百条氨基聚糖链组成。蛋白聚糖含有许多酸性基团，能吸纳大量的水份，从而保证关节软骨良好的粘弹性，抵抗压力。
技术实现思路
本专利技术为解决上述技术问题，提供了一种可用于关节腔内注射的含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物。本专利技术还提出所述含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物的制备方法。本专利技术进一步提出所述含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物的应用。实现本专利技术上述目的的技术方案为：一种含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物，包含再生组织基质微粒和PRP，所述PRP为含有血小板浓度(1200～1600)×109/L的富血小板血浆。再生组织基质微粒和PRP的组合物中，若PRP用量太大，则注射部位容易血栓，用量少则起不到加速关节修复的作用，因此，本专利技术优选所述再生组织基质微粒和PRP的质量体积比为1g：4～6mL。更优选地，所述再生组织基质微粒中DNA残留量在2.0ng/mg以下，所述再生组织基质微粒的粒径在1.2mm以下，D50在0.018～1.0mm之间。本专利技术还提出所述含再生组织基质微粒的关节修复组合物的制备方法。所述的关节软骨修复组合物的制备方法，包括以下步骤：1)将异体皮原料投入碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；2)将半成品A去除表皮后，投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品B；3)将半成品B剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品C；4)在高速旋转离心力的作用下，用转刀对半成品C进行切割，得到半成品D；5)将半成品D置于D-氨基酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品E；所述的D-氨基酸溶液选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种或几种；6)将半成品E与PRP混合，即得植入剂。其中，步骤1)中所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述碱的浓度为0.5～5％；进一步优选碱液的浓度是1～3％；和/或，所述的异体皮原料投入碱的甘油溶液中，优选在25～35℃下浸泡1～10h并振荡处理。其中，步骤2)所述的表面活性剂是SDS或者TritonX-100；所述表面活性剂溶液的浓度为0.1～0.3g/L；超声浸泡条件为：20～45KHz，温度为1～20℃，超声1～5min，浸泡1～4h，优选重复超声和浸泡处理2～6次，重复前换新的表面活性剂溶液。进一步地，将半成品B用交联剂进行交联，然后进行剪裁；所述的交联剂为质量浓度0.1～0.6％的京尼平溶液，交联的时间为2～24h。其中，步骤4)中所述的半成品D由进料口进入速度是50～100g/min，优选地，50～80g/min；优选地，步骤5)采用天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸的浓度分别为0.8～1.4，1.2～1.8，0.4～0.6，4～10.8μmol/L的氨基酸水溶液，按体积比例为1:(0.8～1.2):(0.8～1.2):(0.8～1.2)配制。其中，所述PRP的制备方法为：采集自体静脉血于抗凝管中，第一次相对低速离心，使血浆和血小板与红细胞和白细胞分为三层；取中间层进行第二次相对高速离心，进一步浓缩PRP和分离血小板血浆组分，获得中间层较高浓度的PRP；用氯化钙激活。其中，第一次离心的参数为：120～150×g，离心5～15min；第二次离心的参数为：400～600×g，离心10～25min；优选地；加入1/10体积的10％氯化钙溶液进行激活。本专利技术进一步提出所述的关节修复组合物在制备治疗关节软骨损伤的修复材料中的应用本专利技术的有益效果在于：本专利技术提出的组合物，基于再生组织基质微粒粒径大小的均一、且损失率较低。DNA残留低、且保持了再生组织基质的结构的特性，用以维持疗效时间长且安全、可塑性好的组合物作为关节修复剂。再生组织基质微粒植入剂可明显减轻膝关节疼痛，相较于注射PRP组治疗膝关节炎有更好的长期疗效。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例中涉及的操作如无特殊说明，均为本领域常规技术操作。实施例11)异体皮原料投入碱的甘油溶液中，在25～35℃浸泡1-10小时振荡处理，得半成品A；2)将半成品A去除表皮后，用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入表面活性剂溶液中，在超声频率20-45KHz，超声温度为1-20℃，超声时间1-5分钟min，浸泡1～4h，更换新的表面活性剂溶液，浸泡重复0～4次，得半成品B(具体地，实施例1是2.5h四次。实施例2是2h四次。实施例3是2.5h二次。实施例4是2h一次。实施例5是1h一次)。3)将半成品B用无菌纯水冲洗0.1～5.0min，投入到0～0.6％的京尼平的水溶液中交联(该溶液pH为5～7)，用无菌纯水冲洗1～5h。4)将经过步骤3)的半成品B剪裁成的小皮片的大小是(0.3～1)×(0.3～1)cm2，以沉浸式方式浸入到液氮中5min，得到半成品C。5)将半成品C由进料口进入速度是50-80g/min，在转刀以8000-15000转/min的调频速度高速旋转离心力的作用下，转刀对半成品C进行切割，得到粒径小于环筛孔径2mm的微粒经过环筛被收集在收集器里得到半成品D。6)将半成品D用无菌纯水冲洗5.0min，后置于D-氨基酸溶液中浸泡3-5min，离心过滤得到半成品E。7)PRP的制备过程：静脉抽取患者静脉血于含有枸橼酸钠的离心管中后置入高速离心机，将抽取血液第一次离心后可见血液分为上清血浆层、交界白细胞血小板层及下部的红细胞层。注射器针头抽取上清、交界层、交界层下少许红细胞，移入无菌离心管，第二次离心后用注射器针头去除上层贫血小板血浆后得到富血小板血浆。将0.2ml富血小板血浆用0.9％氯化钠注射液稀释至2mL后送检查验富血小板血浆中血小板浓度，根据各组浓度将所获得的富血小板血浆以0.9％氯化钠注射液稀释至目标范围后留取2mL，加入10％氯化钙0.2ml激活富血小板血浆中的血小板。按照1克半成品E配制加入到5mL的血小板浓度为(1900～2500)×109/L的PRP中。实施例2-5制备的步骤同实施例1，各步骤具体参数见表1。表1实施例1-5试验步骤中各参数DNA残留检测根据《脱细胞异体真皮基质》医疗本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物，其特征在于，包含再生组织基质微粒和PRP，所述PRP为含有血小板浓度(1200～1600)×10

【技术特征摘要】
1.一种含再生组织基质微粒的关节软骨修复组合物，其特征在于，包含再生组织基质微粒和PRP，所述PRP为含有血小板浓度(1200～1600)×109/L的富血小板血浆。2.根据权利要求1所述的关节软骨修复组合物，其特征在于，所述再生组织基质微粒和PRP的质量体积比为1g：4～6mL。3.根据权利要求1所述的关节软骨修复组合物，其特征在于，所述再生组织基质微粒中DNA残留量在2.0ng/mg以下，所述再生组织基质微粒的粒径在1.2mm以下，D50在0.018～1.0mm之间。4.权利要求1～3任一项所述的关节软骨修复组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将异体皮原料投入碱的甘油溶液中，浸泡振荡处理，得半成品A；2)将半成品A去除表皮后，投入表面活性剂溶液中，超声浸泡处理，得半成品B；3)将半成品B剪裁成小皮片，以沉浸的方式浸入到液氮中3～10min，取出为半成品C；4)在高速旋转离心力的作用下，用转刀对半成品C进行切割，得到半成品D；5)将半成品D置于D-氨基酸溶液中浸泡，固液分离得到半成品E；所述的D-氨基酸溶液选自天冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、丝氨酸中的一种或几种；6)将半成品E与PRP混合，即得植入剂。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述碱为氢氧化钠和/或氢氧化钾，所述碱的浓度为0.5～5％；进一步优选碱的浓度是1～3％；和/或，所述的异体皮原料投入碱的甘油溶液中，优选在25～35℃下浸泡1～10h并振荡处理。6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的表面活性剂是SDS或...

【专利技术属性】
技术研发人员：莫丽影，孙善凤，石卫华，王姣，王正元，
申请(专利权)人：北京颢美细胞基因生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11