一种脱细胞神经基质及其制备方法技术

本发明专利技术涉及组织工程材料技术领域，具体涉及一种脱细胞神经基质及其制备方法，制备方法为：将神经组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得神经基质，本发明专利技术制备的脱细胞神经基质能够最大限度地保留神经细胞基质本身的三维结构，具有良好的机械性能，而且不需要外加交联剂进行物理或者化学交联，免疫原性低、毒性低，而且制备方法简单，稳定可靠，成本较低，适宜产业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种脱细胞神经基质及其制备方法
本专利技术涉及组织工程材料
，具体涉及一种脱细胞神经基质及其制备方法。
技术介绍
神经系统是机体内对生理功能活动的调节起到主导作用的系统，主要由神经组织组成，分为中枢神经系统和周围神经系统两大部分，中枢神经系统又包括脑和脊髓，周围神经系统包括脑神经和脊神经。周围神经系统的主要功能是允许针对外部或内部刺激进行运动，感觉和行为改变。当周围神经断裂后，虽然近端神经有较好的再生能力，但由于原有通路的破坏，再生的神经纤维往往支配错误的靶器官，当运动神经纤维错误的支配肌肉会导致运动功能失调，再生的错误感觉神经纤维会导致异位感，自主神经的错接会导致植物神经功能紊乱。一般而言，在相对较短距离(小于5毫米)的外周神经损伤，轴突可以自发再生，但仍然很难达到功能完全恢复，在大于3cm的缺损中，神经修复过程中会发生神经错配。周围神经损伤是使人功能受损的常见创伤方式，影响约2.8％的创伤患者。目前，由于各种原因导致的周围神经损伤患者数量逐年增加，在中国，每年约有50余万人因创伤导致周围神经损伤，周围神经损伤常引起支配区域的感觉和运动功能障碍，而长时间的感觉或运动的缺失将引起肌肉萎缩、关节挛缩畸形等，影响患者生活质量，治疗费用较昂贵，但疗效不佳，给患者和社会带来了巨大的经济负担。周围神经缺损的修复治疗是临床工作中的一大难题,特别是>3cm的较长神经缺损。多年来临床医务工作者和科研人员对周围神经缺损的修复治疗进行了大量临床和实验研究，为周围神经损伤的修复提供了理论和实践基础。脱细胞技术是脱除免疫原性的组织细胞保留细胞外基质的方法，相对于自体神经修复具有缺点，如可供神经移植的自体神经来源极其有限，会对患者造成二次损伤，供体部位发病率增加、供体部位发病率增加，疼痛，瘢痕形成，神经瘤形成和供体区域的感觉丧失等，利用脱细胞技术制备的异种脱细胞神经基质具有以下优点：(1)来源广泛，价格低廉。(2)保留了天然神经内存在的三维网络结构，细胞迁移和神经纤维伸长细胞外基质成分来引导，为轴突再生提供物理指导。(3)保留细胞外基质组分(胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白)等保留完整，纤连蛋白可以促进轴突生长和存活，也可做为细胞表面受体的配体，从而启动影响细胞行为和生存的信号，如细胞黏附、增殖、迁移、分化等。层粘连蛋白促进施万细胞生长，在周围神经修复中发挥作用。(4)经脱细胞处理后的异种神经基质除去了硫酸神经素蛋白多糖(CSPG)，研究表明，CSPG可以抑制轴突生长，因此从神经移植材料中去除CSPG可以促进神经修复，因此，脱细胞技术已成为神经组织修复中非常重要的研究方向和研究内容。目前国内外常用到的脱细胞方法主要有机械法、酶消化法、化学去垢剂法等，然而在单独使用或者联合使用这些方法脱细胞的过程中容易出现细胞抗原性去除不彻底，细胞外基质的三维结构遭到破坏的问题，使得细胞营养供应以及代谢废物排出困难，影响神经修复效果，甚至导致神经修复失败。现有技术中，为了彻底地脱除神经细胞，主要采用先将神经粉粹或者研磨成微粒的方法，这就造成在后续处理中需要多次离心以及多次清洗，不仅加重了对细胞外基质的三维结构的破坏，导致脱细胞神经基质材料力学性能变差、机械强度降低。例如，中国专利文献CN102218160A公开了一种神经组织基质源性组织工程支架材料的制备及其应用。以神经组织为原料，通过药物膨胀、机械粉碎、酶解处理、透析收集等手段提取出利于神经再生的基质成分(包括纳米级胶原微丝、纤粘蛋白微丝和层粘蛋白微丝)，去除了不利于神经再生的免疫原性成分(包括雪旺细胞、磷脂和轴突)。所制备出的神经组织基质源性材料单独或配以其他高分子材料可进一步通过定向结晶、冷冻干燥和交联制备成三维多孔取向支架，或者利用电纺丝技术制备纳米级别薄膜，再缠绕形成神经再生导管。本专利技术方法制备的组织工程用支架或导管有利于种子细胞粘附、增殖、迁移，促进神经再生，可用于神经缺损修复。上述脱细胞神经基质的制备方法中，虽然通过物理和化学交联能够在很大程度上提高脱细胞神经基质的力学强度，使其更加稳定，然而，因外加交联剂本身具有毒性及其残留的问题，植入体内一段时间后易出现免疫反应。
技术实现思路
因此，本专利技术要解决的技术问题在于克服现有技术中的脱细胞神经基质机械性能差，免疫原性和毒性高，质量不稳定的缺陷，从而提供一种脱细胞神经基质及其制备方法。本专利技术提供了一种脱细胞神经基质的制备方法，将神经组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得神经基质。在低渗处理中，将神经组织加入低渗溶液中孵育，孵育温度为2-6℃，孵育时间为15-30h；优选地，所述低渗溶液为超纯水。在胰蛋白酶处理中，将神经组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5-3h；优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶和0.01-0.05％(m/v)EDTA的PBS溶液。在去污剂处理中，将神经组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；优选地，所述去污剂溶液为含0.05-0.3％SDS和0.05-0.3％(m/v)EDTA的的PBS溶液为去污剂溶液或含0.2-0.3％Triton-X100(v/v)和0.05-0.3％(m/v)EDTA的的PBS溶液为去污剂溶液。所述去污剂处理为使用两种去污剂溶液分两次处理，第一次处理中，采用含0.05-0.3％SDS和0.05-0.3％(m/v)EDTA的PBS溶液为去污剂溶液，第二次处理中，采用含0.2-3％Triton-X100(v/v)和0.05-0.3％(m/v)EDTA的PBS溶液为去污剂溶液；优选地，在所述去污剂处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理中，将神经组织加入含10-40μg/mLα-1,3-半乳糖苷酶的PBS溶液中，在25-37℃浸泡1-6小时。在核酸酶处理中，将神经组织加入缓冲细胞液中，然后加入30-60U/ml的DNA酶和0.5-4U/ml的RNA酶，在35-40℃下水浴加热1-6h。所述缓冲细胞液为含5-30mM氯化镁的Tris-Hcl溶液，所述Tris-Hcl溶液的浓度为30-60mM，pH为7-8。在核酸酶处理之后还包括灭菌处理；优选地，在灭菌处理中，将神经组织加入消毒液中浸泡1-6h，所述消毒液为含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4wt％次氯酸钠的PBS溶液，或含有0.05-0.4vt％乙酸和0.05-0.4vt％84消毒液的PBS溶液。神经组织在低渗处理之前还包括前清洗处理；在低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理之后还包括中间清洗处理；在核酸酶处理之后还包括后清洗处理；优选地，在前清洗处理中，将神经组织加入生理盐水中浸泡，然后加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；优选地，在中间清洗处理中，将神经组织加入超纯水中超声清洗，再用超纯水持续冲洗；优选地，在后清洗处理中，将神经组织加入无菌PBS中浸泡。本专利技术提供了一种所述的制备方法制得的脱细胞神经基质。本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的脱细胞神经基质的制备方法，清洗后的神经组织依次经过低渗处理，胰蛋白酶处理和去污剂处理，最后经过核酸酶处理，制得脱细胞神经基质。其中，通本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种脱细胞神经基质的制备方法，其特征在于，将神经组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得神经基质。

【技术特征摘要】
1.一种脱细胞神经基质的制备方法，其特征在于，将神经组织依次通过低渗处理、胰蛋白酶处理、去污剂处理和核酸酶处理，制得神经基质。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在低渗处理中，将神经组织加入低渗溶液中孵育，孵育温度为2-6℃，孵育时间为15-30h；优选地，所述低渗溶液为超纯水。3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于，在胰蛋白酶处理中，将神经组织加入胰蛋白酶溶液中，在37℃下水浴加热0.5-3h；优选地，所述胰蛋白酶溶液为含0.1-0.5％(m/v)胰蛋白酶和0.01-0.05％(m/v)EDTA的PBS溶液。4.根据权利要求1-3中任一所述的制备方法，其特征在于，在去污剂处理中，将神经组织加入去污剂溶液中，在温度为15-25℃下振荡处理15-30h；优选地，以含0.05-0.3％SDS和0.05-0.3％(m/v)EDTA的的PBS溶液为去污剂溶液或含0.2-3％Triton-X100(v/v)和0.05-0.3％(m/v)EDTA的的PBS溶液为去污剂溶液。5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述去污剂处理为使用两种去污剂溶液分两次处理，第一次处理中，采用含0.05-0.3％SDS和0.05-0.3％(m/v)EDTA的PBS溶液为去污剂溶液，第二次处理中，采用含0.2-3％Triton-X100(v/v)和0.05-0.3％(m/v)EDTA的PBS溶液为去污剂溶液；优选地，在所述去污剂处理之后还包括α-1,3-半乳糖苷酶溶液处理，在α-1,...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵子建，王建英，李芳红，潘璐琪，冯文金，史啟，
申请(专利权)人：浙江华臻医疗器械有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33