利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法技术

本发明专利技术提出了一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，包括：(1)微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富脂肪来源间充质干细胞(ASC)并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；(3)脱细胞肥大软骨基质制备。所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养；将上述肥大软骨组织脱细胞，即得脱细胞肥大软骨基质。本发明专利技术制得的脱细胞后的肥大软骨基质免疫原性大大降低，可用于同种异体移植。

Direct preparation of acellular hypertrophic cartilage matrix from adipose tissue

The present invention provides a method for preparing acellular hypertrophic cartilage matrix directly from adipose tissue, which includes: (1) after in vitro proliferation and cultivation of particulate adipose tissue, the formation of tissue blocks rich in adipose-derived mesenchymal stem cells (ASC) and still having multidirectional differentiation potential; (2) in vitro construction of hypertrophic cartilage tissue; (3) preparation of acellular hypertrophic cartilage matrix. The in vitro osteogenesis induction culture in cartilage includes two stages: chondrogenesis induction culture and hypertrophy induction culture. First, chondrogenesis induction culture medium is used to induce culture, then hypertrophy induction culture medium is used to induce culture. The hypertrophic cartilage tissue is acellular, and then the acellular hypertrophic cartilage matrix is obtained. The acellular hypertrophic cartilage matrix prepared by the present invention has greatly reduced immunogenicity and can be used for allotransplantation.

【技术实现步骤摘要】
利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法
本专利技术涉及骨组织再生
，特别是指一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法。
技术介绍
目前，基于干细胞的组织工程骨构建方法是将新鲜获取的干细胞，在体外经过多次传代、扩增后，接种于生物材料，再经过一段时间的体内、外培育后，再生出可用于修复骨缺损的骨移植物。但是目前的方法存在以下几个问题：1)干细胞经过长时间体外传代、增殖后，逐渐丧失了多向的分化潜能，包括骨再生能力；2)传统的骨膜内成骨的诱导分化方案骨再生和血管化能力不足；3)单一干细胞构建的骨移植物缺乏成血管能力。脂肪组织在人体内有存量大、获取方便、对身体损伤小等特点，且脂肪组织中包含丰富的间充质干细胞，即脂肪来源干细胞(Adipose-derivedstemcell,ASC)。ASC具有可分化为多种细胞的能力。研究表明，ASC在不同的体外诱导条件下可分化成骨细胞和软骨细胞，从而达到治疗骨缺损的目的。
技术实现思路
本专利技术提出一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，解决了现有技术中脱细胞同种异体骨移植材料骨诱导性能低，体内成骨效率低的问题。本专利技术的技术方案是这样实现的：一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养；微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织；其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养；(3)将上述肥大软骨组织脱细胞，即得脱细胞肥大软骨基质。作为优选的技术方案，所述体外增殖培养基为：α-MEM+10％FBS+1％PSG+1％HEPES+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(10-5mol/L)+FGF-2(2.5-10ng/mL)+PDGF(5-20ng/mL)。其中α-MEM与FBS、PSG、HEPES为体积比。作为优选的技术方案，所述成软骨诱导培养基诱导培养3-5周；肥大诱导培养基诱导培养2-3周；所述诱导培养基每周换2-3次。作为优选的技术方案，所述脂肪组织为人脂肪组织。作为优选的技术方案，所述步骤(2)中的样本，是经过PBS漂洗的微粒脂肪组织的小团块。作为优选的技术方案，其中成软骨诱导阶段所用培养基为：SFM+BMP-6(5-20ng/mL)+TGF-β3(5-20ng/mL)+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(10-5mol/L)；肥大诱导阶段所用培养基为：SFM+β-甘油磷酸二钠盐(10-2mol/L)+地塞米松(10-8mol/L)+抗坏血酸(10-5mol/L)。其中SFM为：DMEM培养液+1％HSA+1％PSG+1％HEPES+(0.5-2)％ITS+(0.3-1.2)％亚油酸。作为优选的技术方案，所述肥大软骨组织脱细胞，包括：(a)冲洗所述肥大软骨组织，移除液体；(b)之后将冲洗后的肥大软骨组织放入液氮中；从液氮中取出，再放入水浴中；如此反复3-5次；(c)经过步骤(b)处理后，再使用蒸馏水冲洗，即得。作为优选的技术方案，所述步骤(a)使用的冲洗液为PBS。作为优选的技术方案，所述步骤(b)在液氮中的时间每次为8-15分钟；在水浴中的时间每次为8-15分钟。作为优选的技术方案，所述水浴的温度为35-40℃。有益效果(1)本专利技术制得的脱细胞后的肥大软骨基质免疫原性大大降低，可用于同种异体移植。(2)本专利技术利用软骨内成骨诱导方案构建的脱细胞肥大软骨基质在体内有强大的骨再生能力，骨再生效率优于骨膜内成骨诱导方案构建的骨移植物。(3)脂肪组织中的干细胞巢在脂肪组织ECM的保护下，可诱导细胞具备更高的分化潜能。(4)本专利技术将获取的微粒脂肪组织直接种植于培养基上进行培养，而非采用传统的经过传代培养的SVF细胞，此方法保留了细胞间的ECM，为ASC的分化提供了有利的“干细胞巢”，保留了干细胞多向分化与成血管潜能。(5)本专利技术的微粒脂肪组织经历3周的外增殖培养后，仍具有与新鲜制备的ASC类似的细胞表型和多向分化潜能，在体外成软骨诱导条件下可成功分化成肥大软骨组织。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施方案或现有技术中的技术方案，下面将对实施方案或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方案，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为验证实施例1的流程图。图2为验证实施例1得到的肥大软骨组织图。图3为对照实施1例得到的肥大软骨组织图。图4为验证实施例1利用脂肪组织构建的软骨组织和肥大软骨组织分别表达II型胶原和X型胶原的扫描图。图5验证实施例1Nanofat与对照实实施例SVF/Ultrafoam构建的肥大软骨的在细胞培养基中GAG释放量，**p<0.01。图6验证实施例1Nanofat与对照实实施例SVF/Ultrafoam构建的肥大软骨的组织样本中GAG总量，**p<0.01。图7验证实施例1Nanofat与对照实实施例SVF/Ultrafoam构建的肥大软骨组织在裸鼠皮下异位植入8周后，骨和骨髓再生的扫描图。其中：Nanofat：微粒脂肪组织；SVF：脂肪组织来源间质血管组份；Ultrafoam：胶原海绵支架材料。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，包括以下几个步骤：(1)微粒脂肪组织的制备；关于微粒脂肪组织的制备属于本领域成熟的技术，本实施例中的步骤如下：(a)从抽脂手术获取的人脂肪组织，经过生理盐水多次漂洗后，收集上层脂肪组织；(b)将上述上层脂肪组织用剪刀剪碎，1000-2000g离心3-5min，去除上层油脂和下层肿胀液部分，收集中间脂肪层于20mL注射器内；(c)使用一个三通管将两个20mL注射器连接起来，来回推注两个注射器30次，获取微粒脂肪组织；(d)微粒脂肪组织经1000-2000g离心3-5min，去除上层的油脂层，下层为微粒脂肪组织混合物。(2)微粒脂肪组织的体外增殖培养；(a)使用1％琼脂糖凝胶包被6孔板，将上述制备的微粒脂肪组织接种于6孔板，每孔1.5mL；(b)每孔加增殖培养基3-5mL，置于CO2细胞培养箱中培养2-4周，每周换液2-3次；本实施例中培养了3周。其中，增殖培养基为：α-MEM+10％FBS+1％PSG+1％HEPES+FGF-2(5ng/mL)+PDGF(10ng/mL)+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(10-5mol/L)。(c)微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，微粒脂肪组织内干细胞大量增殖，松散的微粒脂肪组织组织逐渐聚集，形成一块富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块。(3)肥大软骨组织的体外构建；(a)步骤(2)的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，其特征在于，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养；微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织；其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养；(3)将上述肥大软骨组织脱细胞，即得脱细胞肥大软骨基质。

【技术特征摘要】
1.一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，其特征在于，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养；微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织；其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养；(3)将上述肥大软骨组织脱细胞，即得脱细胞肥大软骨基质。2.根据权利要求1所述的一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，其特征在于，所述成软骨诱导培养基诱导培养3-5周；肥大诱导培养基诱导培养2-3周；所述诱导培养基每周换2-3次。3.根据权利要求1所述的一种利用脂肪组织直接制备脱细胞肥大软骨基质的方法，其特征在于，所述脂肪组织为人脂肪组织。4.根据权利要求1所述的一种...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄如林，李青峰，王文进，李佳奇，傅娆，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31