利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法技术

本发明专利技术提出了一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养，形成富含丰富脂肪来源间充质干细胞(ASC)并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建，取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织。其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养。本方法保留了细胞间的细胞外基质(ECM)，为ASC的分化提供了有利的“干细胞巢”，保留了干细胞多向分化潜能。

Direct regeneration of hypertrophic cartilage by adipose tissue

The invention provides a method for directly regenerating hypertrophic cartilage tissue by adipose tissue, which includes: (1) in vitro proliferation and culture of particulate adipose tissue, formation of tissue blocks rich in adipose-derived mesenchymal stem cells (ASC) and still having multidirectional differentiation potential; (2) in vitro construction of hypertrophic cartilage tissue, taking steps: (1) in vitro proliferation and culture of samples, and in vitro osteogenesis. The hypertrophic cartilage tissue was directly differentiated into hypertrophic cartilage tissue by induction culture. The in vitro cartilage osteogenesis induction culture includes two stages: chondrogenesis induction culture and hypertrophy induction culture; first, chondrogenesis induction culture medium is used, and then hypertrophy induction culture medium is used. This method retains the intercellular extracellular matrix (ECM), provides a favorable \stem cell nest\ for the differentiation of ASC, and retains the multidirectional differentiation potential of stem cells.

【技术实现步骤摘要】
利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法
本专利技术涉及骨组织再生
，特别是指一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法。
技术介绍
传统骨组织工程技术是将干细胞种植于生物材料上，经过一段时间的体外培养后，干细胞在生物材料上分化成骨细胞，分泌骨胶原，最终再生出新生骨组织，然后移植于骨缺损处，修复功能与外形的缺陷。目前，将实验室的骨组织工程技术转化应用到临床主要面临两大挑战：一方面，难于获取到取材方便、损伤小、骨再生能力强的干细胞。目前，基于干细胞的组织工程技术主要通过体外扩增的方法从有限的临床组织样本中获取足够数量的干细胞，然后用于实验室骨组织构建。但是，干细胞的成骨分化能力会随着体外的传代扩增而逐渐降低2，多次传代的干细胞其诱导体内骨再生的能力显著降低。另一方面，体外构建的骨组织缺乏有效的血管系统，大体积的组织工程化骨组织移植到受区后很难与受区再血管化，而导致移植手术失败3,4。有效地解决这两大难题将会为组织工程技术的临床转化清除障碍。由于脂肪组织在人体存量大、获取方便、对机体损伤小，越来越多的研究者开始使用脂肪来源干细胞(Adipose-derivedstemcell,ASC)用于骨再生研究。研究表明，ASC在不同的体外诱导条件下可分化成骨细胞和软骨细胞5,6；在动物实验中，将负载ASC的生物材料经过体外成骨诱导培养后植入到骨缺损处，可以促进缺损部位骨再生7,8，其修复效果类似于负载了骨髓间充质干细胞(Bonemarrow-derivedmesenchymalstemcell,BMSC)的同类型生物材料9,10。虽然ASC被证实可以有效诱导骨再生，但不容忽视的一个问题是ASC也会因传代次数增加而逐渐丧失其作为间充质干细胞(mesenchymalstemcell,MSC)的多向分化潜能。目前的方法存在以下几个问题：1)干细胞经过长时间体外传代后，逐渐丧失多向的分化潜能，包括骨再生能力；2)传统的骨膜内成骨分化方案骨再生能力不足；3)单一干细胞构建的骨移植物缺乏成血管能力。由于ASC具有可分化为多种细胞的功能，研究表明，ASC在不同的体外诱导条件下可分化成骨细胞和软骨细胞，从而达到治疗骨缺损的目的。研究发现细胞外基质(Extracellularmatrix,ECM)可以为干细胞提供三维生存空间，调节各类生物信号分子进入干细胞巢，对干细胞的生物功能和分化命运起到了重要的调节作用。为提高骨缺损修复效率、简化骨组织再生程序，有必要研发一种新的直接利用脂肪组织再生可用于骨缺损的肥大软骨组织的方法，该方法需要保护干细胞的多向分化潜能。参考文献：1.CampanaV,MilanoG,PaganoE,BarbaM,CicioneC,SalonnaG,LattanziW,LogroscinoG.Bonesubstitutesinorthopaedicsurgery:frombasicsciencetoclinicalpractice.JMaterSciMaterMed.2014；25(10):2445-2461.2.DiMaggioN,MartellaE,FrismantieneA,ResinkTJ,SchreinerS,LucarelliE,JaquieryC,SchaeferDJ,MartinI,ScherberichA.Extracellularmatrixandalpha5beta1integrinsignalingcontrolthemaintenanceofboneformationcapacitybyhumanadipose-derivedstromalcells.SciRep.2017；7:44398.3.Mercado-PaganAE,StahlAM,ShanjaniY,YangY.Vascularizationinbonetissueengineeringconstructs.AnnBiomedEng.2015；43(3):718-729.4.LiuY,ChanJK,TeohSH.Reviewofvascularisedbonetissue-engineeringstrategieswithafocusonco-culturesystems.JTissueEngRegenMed.2015；9(2):85-105.5.MellorLF,Mohiti-AsliM,WilliamsJ,KannanA,DentMR,GuilakF,LoboaEG.ExtracellularCalciumModulatesChondrogenicandOsteogenicDifferentiationofHumanAdipose-DerivedStemCells:ANovelApproachforOsteochondralTissueEngineeringUsingaSingleStemCellSource.TissueEngPartA.2015；21(17-18):2323-2333.6.GeW,LiuY,ChenT,ZhangX,LvL,JinC,JiangY,ShiL,ZhouY.Theepigeneticpromotionofosteogenicdifferentiationofhumanadipose-derivedstemcellsbythegeneticandchemicalblockadeofhistonedemethylaseLSD1.Biomaterials.2014；35(23):6015-6025.7.HungBP,HuttonDL,KozielskiKL,BishopCJ,NavedB,GreenJJ,CaplanAI,GimbleJM,DorafsharAH,GraysonWL.Platelet-DerivedGrowthFactorBBEnhancesOsteogenesisofAdipose-DerivedButNotBoneMarrow-DerivedMesenchymalStromal/StemCells.StemCells.2015；33(9):2773-2784.8.ParkHJ,YuSJ,YangK,JinY,ChoAN,KimJ,LeeB,YangHS,ImSG,ChoSW.Paper-basedbioactivescaffoldsforstemcell-mediatedbonetissueengineering.Biomaterials.2014；35(37):9811-9823.9.HiwatashiN,HiranoS,MizutaM,TateyaI,KanemaruS,NakamuraT,ItoJ.Adipose-derivedstemcellsversusbonemarrow-derivedstemcellsforvocalfoldregeneration.Laryngoscope.2014；124(12):E461-469.10.HanDS,ChangHK,KimKR,WooSM.Considerationofboneregenerationeffectofstemcells:comparisonofboneregenerationbetweenbon本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法，其特征在于，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养；微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织；其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养。

【技术特征摘要】
1.一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法，其特征在于，包括：(1)微粒脂肪组织的体外增殖培养；微粒脂肪组织经过体外增殖培养后，形成富含丰富ASC并仍具有多向分化潜能的组织块；(2)肥大软骨组织的体外构建；取步骤(1)体外增殖培养后的样本，经过体外软骨内成骨诱导培养，直接分化成肥大软骨组织；其中，所述体外软骨内成骨诱导培养包括成软骨诱导培养和肥大诱导培养两个阶段；先使用成软骨诱导培养基诱导培养，然后使用肥大诱导培养基诱导培养。2.根据权利要求1所述的一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法，其特征在于，所述体外增殖培养基为：α-MEM+10％FBS+1％PSG+1％HEPES+地塞米松(10-7mol/L)+抗坏血酸(10-5mol/L)+FGF-2(2.5-10ng/mL)+PDGF(5-20ng/mL)；其中α-MEM与FBS、PSG、HEPES为体积比。3.根据权利要求1或2所述的一种利用脂肪组织直接再生肥大软骨组织的方法，其特征在于，所述体外增殖培养的时间为2-4周，每周更换2-3次。4.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄如林，李青峰，王文进，李佳奇，傅娆，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属第九人民医院，
类型：发明
国别省市：上海,31