一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术公开了一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。本发明专利技术为了减少杂质的生成并提高丁二酸的产量，在大肠杆菌中引入了Ⅱ型甘油代谢系统，通过对重组菌Suc‑T11进行分子改造，构建了在厌氧条件下工作的电子传递链，提高了能量的供应能力，进而提高了丁二酸产量。实验证明：本发明专利技术构建的重组菌YY‑GS004在批式发酵中，丁二酸产量达到了482.5mM，是其亲本的3.82倍，转化率达到了0.92mol丁二酸/mol甘油，达到理论值的92％，接近理论转化率；在好氧‑厌氧两步法的补料发酵中，丁二酸的产量达到了565.3mM。本发明专利技术构建得到的重组菌在丁二酸生产中具有重大意义。

A Recombinant Bacterium Producing Succinic Acid with Glycerol as Substrate and Its Construction Method and Application

The invention discloses a recombinant bacterium producing succinic acid with glycerol as substrate, and its construction method and application. In order to reduce the generation of impurities and increase the production of succinic acid, type II glycerol metabolic system was introduced into Escherichia coli. Through molecular modification of recombinant bacteria Suc T11, an electron transfer chain working under anaerobic conditions was constructed, and the energy supply capacity was improved, thus the production of succinic acid was increased. Experiments show that in batch fermentation, the yield of succinic acid reached 482.5mM, 3.82 times that of its parents, and the conversion rate reached 0.92 mol succinic acid/mol glycerol, reaching 92% of the theoretical value, which is close to the theoretical conversion rate. In aerobic and anaerobic two-step fed-batch fermentation, the yield of succinic acid reached 565.3mM. The recombinant bacteria constructed by the invention has great significance in the production of succinic acid.

【技术实现步骤摘要】
一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用
本专利技术属于生物
，具体涉及一株以甘油为底物生产丁二酸的重组菌及其构建方法与应用。
技术介绍
丁二酸是一种重要的有机化工原料，广泛应用于农业、食品、药品工业中，是美国能源部认定的12种最具价值的大宗化学品之一。作为一种优秀的C4平台化合物，丁二酸可以用于合成环保溶剂、药剂制品和可降解塑料等多种化工产品。传统的生产丁二酸的方法是以顺丁烯二酸酐为底物通过石化法来生产，但石油价格波动、环境污染大、生产工艺复杂、生产成本高，导致丁二酸的应用受到严重限制。利用微生物发酵生产丁二酸，具有成本低、污染小、环境友好的优势，因此开发高效的生物法生产丁二酸策略具有十分重要的经济和环境效益。到目前为止，科学家们已经构建出了许多能够高效生产丁二酸的菌株，例如经过基因工程改造的大肠杆菌Escherichiacoli(TanZ,ZhuX,ChenJ,etal.Activatingphosphoenolpyruvatecarboxylaseandphosphoenolpyruvatecarboxykinaseincombinationforimprovementofsuccinateproduction[J].Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013,79(16):4838-4844.)和曼海姆产琥珀酸菌Mannheimiasucciniciproducens(AhnJH,JangYS,SangYL.Productionofsuccinicacidbymetabolicallyengineeredmicroorganisms[J].CurrentOpinioninBiotechnology,2016,42:54-66.)，但这些菌都是以葡萄糖为碳源进行琥珀酸的发酵生产。甘油是一种在生物柴油生产过程中产生的副产物，每生产9吨生物柴油就会产生约1吨的粗甘油。随着生物柴油产量的不断增加，副产物甘油的产量也迅速增加，由于生产生物柴油时产生的粗甘油中含有盐类、甲醇、皂等杂质，所以必须精制后才能利用，但其精制成本高，在经济上并不可行。如何对副产物粗甘油进行开发利用，已成为生物柴油产业可持续发展的关键和保障。如果可以将副产物甘油通过发酵生产转化为高附加值的丁二酸，就能有效降低生物柴油的生产成本，同时也能降低丁二酸的生产成本，提升生物柴油的整体技术水平和效益。一些瘤胃细菌如产琥珀酸放线杆菌Actinobacillussuccinogenes就能够在厌氧条件下利用甘油生产丁二酸。但是以甘油为底物在厌氧条件下进行发酵时，生物质的合成会造成氧化还原的不平衡，进而抑制细胞生长(CarvalhoM,MatosM,RocaC,etal.SuccinicacidproductionfromglycerolbyActinobacillussuccinogenesusingdimethylsulfoxideaselectronacceptor[J].NewBiotechnology,2014,31(1):133-139.)。所以产琥珀酸放线杆菌A.succinogenes和其他的一些巴斯德氏菌在以甘油为底物厌氧发酵时，都必须添加酵母提取物或者电子受体来提供细胞生长所需的物质或消耗过剩的还原力(SchindlerBD,JoshiRV,VieilleC.RespiratoryglycerolmetabolismofActinobacillussuccinogenes130Zforsuccinateproduction[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2014,41(9):1339-1352.)。即便如此，在厌氧条件下甘油产丁二酸的产量也不高，A.succinogenes生产丁二酸的产量仅有29.3g/L，生产速度为0.27g/L/h。但是甘油的还原力比葡萄糖要高，以甘油为底物产丁二酸的氧化还原是平衡的，不需要还原力回补。而以葡萄糖为底物生产丁二酸则需要进行代谢调控，从磷酸戊糖途径回补还原力来解决氧化还原不平衡的问题。目前关于甘油产丁二酸的研究都集中在两步法发酵(LiQ,WuH,LiZ,etal.EnhancedsuccinateproductionfromglycerolbyengineeredEscherichiacolistrains[J].BioresourceTechnology,2016,218:217-223.)、添加电子受体(SchindlerBD,JoshiRV,VieilleC.RespiratoryglycerolmetabolismofActinobacillussuccinogenes130Zforsuccinateproduction[J].JournalofIndustrialMicrobiology&Biotechnology,2014,41(9):1339-1352.)或是微氧发酵(WangC,CaiH,ChenZ,etal.EngineeringaglycerolutilizationpathwayinCorynebacteriumglutamicumforsuccinateproductionunderO2deprivtion[J].BiotechnologyLetters,2016,38(10):1791-1797.)等方面。但这些方法会对产量、转化率等造成一定的负面影响。产琥珀酸放线杆菌A.succinogenes和大肠杆菌Escherichiacoli中原有的代谢甘油产丁二酸的代谢通路能量供应水平低，所以菌体在厌氧发酵时生长极差，或者需要产甲酸、乙醇等杂质来供应生长代谢所需的能量。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何提高丁二酸产量。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种重组菌的构建方法。本专利技术提供的重组菌的构建方法包括如下步骤：对受体菌进行如下(1)-(3)所述的改造：(1)抑制或降低所述受体菌中甘油激酶glpK的表达量和/或活性，或抑制所述受体菌中甘油激酶基因glpK的表达，或敲除所述受体菌中的甘油激酶基因glpK；(2)抑制或降低所述受体菌中磷酸烯醇式丙酮酸依赖型二羟基丙酮激酶dhaKLM的表达量和/或活性，或抑制所述受体菌中dhaKLM基因簇的表达，或敲除所述受体菌中的dhaKLM基因簇；(3)提高所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶dhaK的表达量和/或活性，或增强所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶基因dhaK的表达；所述受体菌为可以甘油为底物在厌氧条件下发酵生产丁二酸的菌。上述重组菌的构建方法中，所述甘油激酶glpK为如下a1)或a2)所示的蛋白质：a1)由GenBank号为ACA79690.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)将GenBank号为ACA79690.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有甘油激酶glpK活性的由a1)衍生的蛋白质；所述磷酸烯醇式丙酮酸依赖型二羟基丙酮激酶dhaKLM由dhaK亚基、dhaL亚基和dhaM亚基组成；所述dhaK亚基为如下b1)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：对受体菌进行如下(1)‑(3)所述的改造：(1)抑制或降低所述受体菌中甘油激酶glpK的表达量和/或活性或抑制所述受体菌中甘油激酶基因glpK的表达或敲除所述受体菌中的甘油激酶基因glpK；(2)抑制或降低所述受体菌中磷酸烯醇式丙酮酸依赖型二羟基丙酮激酶dhaKLM的表达量和/或活性或抑制所述受体菌中dhaKLM基因簇的表达或敲除所述受体菌中的dhaKLM基因簇；(3)提高所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶dhaK的表达量和/或活性或增强所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶基因dhaK的表达；所述受体菌为可以甘油为底物在厌氧条件下发酵生产丁二酸的菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌的构建方法，包括如下步骤：对受体菌进行如下(1)-(3)所述的改造：(1)抑制或降低所述受体菌中甘油激酶glpK的表达量和/或活性或抑制所述受体菌中甘油激酶基因glpK的表达或敲除所述受体菌中的甘油激酶基因glpK；(2)抑制或降低所述受体菌中磷酸烯醇式丙酮酸依赖型二羟基丙酮激酶dhaKLM的表达量和/或活性或抑制所述受体菌中dhaKLM基因簇的表达或敲除所述受体菌中的dhaKLM基因簇；(3)提高所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶dhaK的表达量和/或活性或增强所述受体菌中ATP依赖型二羟基丙酮激酶基因dhaK的表达；所述受体菌为可以甘油为底物在厌氧条件下发酵生产丁二酸的菌。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述甘油激酶glpK为如下a1)或a2)所示的蛋白质：a1)由GenBank号为ACA79690.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；a2)将GenBank号为ACA79690.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有甘油激酶glpK活性的由a1)衍生的蛋白质；所述磷酸烯醇式丙酮酸依赖型二羟基丙酮激酶dhaKLM由dhaK亚基、dhaL亚基和dhaM亚基组成；所述dhaK亚基为如下b1)或b2)所示的蛋白质：b1)由GenBank号为AYB98152.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b2)将GenBank号为AYB98152.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有dhaK亚基活性的由b1)衍生的蛋白质；所述dhaL亚基为如下c1)或c2)所示的蛋白质：c1)由GenBank号为AYB98153.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；c2)将GenBank号为AYB98153.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有dhaL亚基活性的由c1)衍生的蛋白质；所述dhaM亚基为如下d1)或d2)所示的蛋白质：d1)由GenBank号为AYB98154.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；d2)将GenBank号为AYB98154.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有dhaM亚基活性的由d1)衍生的蛋白质；所述ATP依赖型二羟基丙酮激酶dhaK为如下e1)或e2)所示的蛋白质：e1)由GenBank号为ARI10515.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；e2)将GenBank号为ARI10515.1所示的氨基酸序列经过取代和/或缺失/或添加一个或几个氨基酸残基得到的具有ATP依赖型二羟基丙酮激酶dhaK活性的由e1)衍生的蛋白质。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述甘油激酶基因glpK为如下f1)-f3)中任一种DNA分子：f1)序列1所示的cNDA分子或基因组DNA分子；f2)在严格...

【专利技术属性】
技术研发人员：张学礼，于勇，徐洪涛，刘茹，
申请(专利权)人：中国科学院天津工业生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：天津,12