一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D‑木糖酸方法，是以大肠杆菌W3110为出发菌株，连续敲除其内源性基因获得工程菌E.coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac‑xylBC导入E.coli XGL2中，得到能高产D‑木糖酸的工程大肠杆菌E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC；再以玉米芯水解液为底物，生物发酵E.coli XGL2/pETPtac‑xylBC，由发酵液得到D‑木糖酸。实验证实本发明专利技术方法能够生产获得D‑木糖酸91.2g/L，得率为1.05g D‑木糖酸/1g D‑木糖，生产效率为1.52g/[L·h]，为工业化生产D‑木糖酸并充分利用玉米芯提供了新途径。

【技术实现步骤摘要】
一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物高产D-木糖酸的方法
本专利技术涉及一种发酵生产D-木糖酸的方法。尤其涉及一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸的方法。
技术介绍
玉米芯是第二大农作物废料(KumarVetal.,Bioresour.Technol.,2018,251:416-419)，仅我国的玉米芯年产量就超过4千万吨(中国农业资源与区划.2016,37:1-8)。玉米芯经过简单处理后，可以形成富含木糖和少量葡萄糖的玉米芯水解液(KoqjeAetal.,3Biotech,2016,6:127；CaiDetal.,Bioresour.Technol.,2016,211:677-684)，后者主要被用于制备D-木糖和木糖醇。相对于年需求量为24万吨的木糖醇来说，产能过剩的玉米芯如果处理不当则会造成环境问题(ZhangHetal.,Bioresour.Technol.,2018,257:223-228；VenkateswarRaoLetal.,Bioresour.Technol.,2016,213:199-310；ChenMetal.,Carbohyd.Polym.,2008,71:411-415)。因此，迫切需要开发新的玉米芯利用技术，以缓解玉米芯产量不断增多造成的环境压力。D-木糖酸是一种五碳有机酸，可以应用在很多领域，例如食品、工业、医药等行业(Yetal.,Metab.Eng.,2011,13:383-391；ToivariMHetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8；MaJetal.,GreenChem.,2016,18:1738-1750)。它还可以作为前体物质，用于1,2,4-丁三醇、1,4-丁二醇、3,4-二羟基丁醛、3,4-二羟基丁酸等重要化学品的生产(ZhangNetal.,EnzymeMicrob.Technol.,2016,93:51-58；WangJetal.,Metab.Eng.,2017,41:39-45；LiuHetal.,Metab.Eng.,2015,29:135-141)。由于其广泛的用途和工业化生产潜力，因此被美国能源部门评为前三十种重要化学品之一(CaoYetal.,PLoSOne,2013,8:e67305)。根据文献报道，目前微生物法生产D-木糖酸的主要菌株包括筛选得到的野生菌和代谢工程改造后的基因工程菌。天然野生菌包括葡萄杆菌属、肠杆菌属和假单胞菌属等(BuchertJetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,1988,27:333-336)。基因工程菌包括代谢工程改造后的酿酒酵母、大肠杆菌等。例如，Toivari等人在酿酒酵母中外源表达了里氏木霉中的木糖脱氢酶(xyd1)，生产了3.8g/LD-木糖酸(ToivariMHetal.,Appl.Microbiol.Biotechnol.,2012,96:1-8)，后续又在具有水解液耐受性的酿酒酵母中敲除醛糖还原酶(GRE3)，又表达来自月柄杆菌的木糖脱氢酶(xylB)后，生产了43g/LD-木糖酸(ToivariMetal.,Metab.Eng.,2012,14:427-436)。Liu等人在大肠杆菌W3110中进行代谢工程改造，并外源表达xylB，实现了39.2g/L的D-木糖酸积累(LiuHetal.,Bioresour.Technol.,2012,115:244-248)。利用天然野生菌生产D-木糖酸具有诸多缺点，例如，菌株培养条件复杂，成本高，产物不单一等。而利用基因工程菌生产D-木糖酸则具有生产效率低，产量低等限制工业化生产的问题。因此，迫切需要开发出一种利用工程菌以玉米芯水解液为底物，高产D-木糖酸的方法，既要解决D-木糖酸生产效率低，产量低的问题，又要为玉米芯产能过剩问题提供新思路。然而，目前尚未有利用玉米芯水解液生产D-木糖酸的报道。
技术实现思路
针对上述现有方法中，产品成本高、生产效率低、产量低、难以工业化生产的不足，本专利技术要解决的问题是提供一种利用构建的基因工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸的方法，为玉米芯产能过剩提供一种利用途径。本专利技术所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，步骤是：(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术(DatsenkoKAetal.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,2000,97:6640-6645)连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β-半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为EscherichiacoliXGL2；将构建的重组质粒pETPtac-xylBC导入EscherichiacoliXGL2中，获得在EscherichiacoliXGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC；(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC，由发酵液得到D-木糖酸；其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D-木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。上述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法中，步骤(一)所述工程大肠杆菌EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC的构建方法是：(1)采用中拷贝、含强启动活性Tac启动子的pETPtac表达载体外源表达来自月柄杆菌(Caulobactercrescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，构建得到重组质粒pETPtac-xylBC；其中，所述木糖脱氢酶的xylB基因序列长度为747个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述木糖酸内酯酶的xylC基因序列长度为870个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；该重组质粒pETPtac-xylBC图谱如图1所示；(2)采用基因工程手段在野生型大肠杆菌W3110中敲除内源性木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF，阻断内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，得到工程大肠杆菌，命名为E.coliX3；其中：所述大肠杆菌内源性木糖异构酶基因xylA核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述木糖酸脱水酶基因yjhG核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；所述木糖酸脱水酶基因yagF核苷酸序列如SEQIDNO.5所示；(3)采用基因工程手段在E.coliX3菌株中敲除内源性乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D‑木糖酸方法，步骤是：(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β‑半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为Escherichia coli XGL2；将构建的重组质粒pETPtac‑xylBC导入Escherichia coli XGL2中，获得在Escherichia coli XGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D‑木糖酸的工程大肠杆菌，命名为Escherichia coli XGL2/pETPtac‑xylBC；(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌Escherichia coli XGL2/pETPtac‑xylBC，由发酵液得到D‑木糖酸；其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；玉米芯水解液成分中D‑木糖与D‑葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D‑木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。...

【技术特征摘要】
1.一种利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，步骤是：(一)以大肠杆菌W3110为出发菌株，用代谢工程手段对其改造：采用一步法敲除技术连续敲除木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF、乳酸脱氢酶基因ldhA、乙醇脱氢酶基因adhE、丙酮酸氧化酶基因poxB、乙酸激酶基因ackA、特异性葡萄糖转运蛋白基因ptsG和β-半乳糖苷酶基因lacZ，获得的工程菌命名为EscherichiacoliXGL2；将构建的重组质粒pETPtac-xylBC导入EscherichiacoliXGL2中，获得在EscherichiacoliXGL2中表达木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC的高产D-木糖酸的工程大肠杆菌，命名为EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC；(二)以玉米芯水解液为底物，生物发酵步骤(一)获得的工程大肠杆菌EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC，由发酵液得到D-木糖酸；其中，所述发酵条件是：培养温度为37±1℃，培养方式为搅拌培养，搅拌转速为600±50转/分钟，通气量为1.0±0.1vvm，采用14％的氨水自动调节pH至7.0±0.4，培养时间为36～60小时；玉米芯水解液成分中D-木糖与D-葡萄糖的含量比例在6:1～12:1，D-木糖含量不低于40g/L；不使用IPTG诱导，使用乳糖进行诱导。2.根据权利要求1所述利用工程大肠杆菌以玉米芯水解液为底物发酵生产D-木糖酸方法，其特征在于，步骤(一)所述工程大肠杆菌EscherichiacoliXGL2/pETPtac-xylBC的构建方法是：(1)采用中拷贝、含强启动活性Tac启动子的pETPtac表达载体外源表达来自月柄杆菌(Caulobactercrescentus)中木糖脱氢酶基因xylB及木糖酸内酯酶基因xylC，构建得到重组质粒pETPtac-xylBC；其中，所述木糖脱氢酶的xylB基因序列长度为747个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述木糖酸内酯酶的xylC基因序列长度为870个碱基，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；(2)采用基因工程手段在野生型大肠杆菌W3110中敲除内源性木糖异构酶基因xylA、木糖酸脱水酶基因yjhG和yagF，阻断内源性D-木糖及D-木糖酸代谢途径，得到工程大肠杆菌，命名为E.coliX3；其中：所述大肠杆菌内源性木糖异构酶基因xylA核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；所述木糖酸脱水酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：高超，马翠卿，张一鹏，许平，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37