一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法技术

本发明专利技术属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。本发明专利技术提供的方法使用BAC克隆、酶切打断以及不对称扩增等方法制备探针文库，使得产品灵敏度、特异性以及信号强度均得到有效提高。

【技术实现步骤摘要】
一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法
本专利技术属于生物化学领域，具体属于生物化学相关的测定或检测领域；更具体涉及一种TOP2A基因的FISH探针的制备方法，及由该方法制备出的探针。
技术介绍
DNA拓扑异构酶(Topoismoerase,TOP)是细胞内重要的核酶，主要通过催化作用改变DNA的拓扑结构。真核细胞的拓扑异构酶主要分为TOP1和TOP2。其中，在催化过程中形成的中间产物造成DNA双链短暂断裂的称为TOP2。在细胞DNA复制、转录和有丝分裂等重要的生命过程中，TOP2都发挥重要作用。基于对TOP在细胞中关键作用的认识，对该类物质的研究一直是抗肿瘤药物研发的热点之一。目前已上市的拓扑异构酶II抑制剂有依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、伊达比星、表柔比星和米托蒽醌等。TOP2A的作用在于介导DNA双链解螺旋(断裂和再连接)，其编码的DNA拓扑异构酶Ⅱα(TOPIIα)，具有介导DNA解结或解旋等重要功能，是蒽环类药物和拓扑异构酶抑制剂依托泊苷的重要靶点。TOP2A基因在乳腺癌中的扩增频率约为10％，缺失频率约为3％～12％。临床研究表明，TOP2A基因异常的患者无复发生存期(RFS)缩短，预后差，尤其是TOP2A基因缺失的患者预后更差；TOP2A基因异常的患者接受蒽环类药物的化疗方案效果要优于TOP2A基因正常的患者，TOP2A异常的患者使用CEF方案(环磷酰胺+表阿霉素+氟尿嘧啶，其中表阿霉素为蒽环类药物)进行治疗可降低65％的复发风险和71％的死亡风险，而TOP2A正常的患者使用此方案只能降低6％的复发风险和10％的死亡风险。因此，检测乳腺癌患者中TOP2A的基因状态对于判断预后、评价药物疗效以及指导临床合理用药有重要意义。目前在实际应用中，对于TOP2A基因状态检测的常用方法主要有荧光原位杂交法(FISH)和显色原位杂交法(CISH)。FISH法是一种应用非放射性荧光物质依靠核酸探针杂交原理在细胞核中或染色体上显示DNA存在与含量的方法。该技术具有快速、安全、灵敏度高以及探针可长期保存等特点，目前已广泛应用于细胞遗传学、肿瘤生物学、基因定位、基因作图、产前诊断及哺乳动物染色体进化研究等领域。CISH法将癌基因探针用地高辛或生物素标记，利用过氧化物酶或碱性磷酸酶的反应使在光学显微镜下检测石蜡组织mRNA的表达水平。虽然这两种均基于原位杂交的原理，但在实际应用中，多以FISH法进行检测。例如，中国专利申请201510053891.1公开了一种TOP2A基因异常检测探针、试剂盒以及方法，所述试剂盒包括有标记荧光染料的、针对TOP2A基因的第一组探针和针对人类17号染色体着丝粒区域的第二组探针，所述第一组探针对选自SEQIDNO.41-50中的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQIDNO.51-60中的至少一条探针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。该申请所提供的TOP2A基因异常检测试剂盒中的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉反应，与染色体中TOP2A目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性低的优点。根据上述申请公开的内容不难看出，其采用的技术思路为：1、涉及扩增引物用于扩增探针并构建探针库(在此步骤中该申请采用常规T-A克隆方式直接对扩增产物进行建库，并未对扩增产物做任何其它处理)；2、将上述探针库标记后直接用于样本检测。上述技术思路为FISH检测法的常规方式，对其具体操作细节进行深入分析，可以发现：(1)探针针对待检样本的目标DNA区域进行涉及，通常情况下一条探针DNA分子结合一条目标DNA分子，一旦发生单条探针脱靶，对检测信号有明显影响；(2)单条探针脱靶对检测信号的影响继而会间接影响检测的准确性，出现假阳性和假阴性信号的可能性增加；(3)除了对检测信号以及准确性的影响之外，单条探针的脱靶也会明显降低检测的灵敏度；(4)此外，针对TOP2A涉及的探针分子长度在300bp左右，作为本领域公知，探针分子越大，越不容易进入细胞内部。由此可见，现有的TOP2A基因的检测技术虽然在一些方面取得了比较好的效果，但是由于其设计原理等方面的限制，仍存在诸多技术问题。针对以上技术问题，本专利技术提供了一种新的FISH探针制备方法，该方法对常规方法扩增出的探针进行具有针对性的打断处理以及不对称扩增处理等方式，将探针打断成更小的片段，且形成单双链混合的探针组等形式。由此带来的技术改进为：1、获得的探针文库片段更小，更容易进入待检样本细胞；杂交所需时间更短；2、获得探针组是单双链混合，信号强度更好；3、获得的探针文库可以实现多条探针DNA分子结合一条目标DNA分子，即荧光信号会由多条特异性探针组合定位，特异性更高，单条探针脱靶不会对结果信号产生较大的影响，检测灵敏度更高，假阳性和假阴性信号的可能性更小，检测准确性更高。
技术实现思路
鉴于上述本领域存在的技术问题，本专利技术的公开旨在提供一种TOP2A基因的FISH探针文库的制备方法；同时提供由此方法制备得到的用于检测TOP2A基因异常的FISH探针文库及包含此探针文库的试剂盒；还提供基于上述制备方法的TOP2A基因异常的检测方法。一方面，本专利技术提供了一种TOP2A基因的FISH探针文库的制备方法，所述的制备方法包括以下步骤：(1)制备得到探针1；(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库。所述的制备方法步骤(1)中的探针1为探针1A和/或探针1B；当探针1为探针1A和探针1B时，分别提取BAC克隆质粒制备得到探针1A对应的FISH探针文库以及探针1B对应的FISH探针文库。所述的探针1A为针对TOP2A基因的一条或多条探针。当探针1A为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；优选地，当探针1A为多条探针时，各条探针以等摩尔浓度比混合；更优选地，当探针1A为多条探针时，各条探针以1ng/μL的浓度等比例混合。所述的探针1A能够和TOP2A基因的部分或全部序列杂交结合。所述的探针1A可以选自BAC克隆RP11-885J9、BAC克隆RP11-513C18和BAC克隆RP11-38L14中的一种或多种。所述的探针1B为针对人类17号染色体着丝粒区域的一条或多条探针。当探针1B为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；优选地，当探针1B为多条探针时，各条探针以等摩尔浓度比混合；更优选地，当探针1B为多条探针时，各条探针以1ng/μL的浓度等比例混合。所述的探针1B能够和17号染色体着丝粒区域的部分或全部序列杂交结合。所述的探针1B可以选自BAC克隆RP11-25J2、BAC克隆RP11-102E1和BAC克隆RP11-319E24中的一种。本专利技术中：所述的BAC克隆RP11-885J9购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-885J9；所述的BAC克隆RP11-513C18购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.C-513C18；所述的BAC克隆RP11-38L14购自Invitrogen公司，商品名为BAC克隆，货号为RPCI11.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种TOP2A基因的FISH探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)制备得到探针1；(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库。

【技术特征摘要】
1.一种TOP2A基因的FISH探针文库的制备方法，其特征在于：所述的制备方法包括以下步骤：(1)制备得到探针1；(2)酶切打断步骤(1)获得的探针1，得到探针2；(3)给步骤(2)获得的探针2添加接头，得到探针3；(4)对步骤(3)获得的探针3进行不对称扩增，得到FISH探针文库。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中的探针1为探针1A和/或探针1B；当探针1为探针1A和探针1B时，分别制备得到探针1A对应的FISH探针文库以及探针1B对应的FISH探针文库；所述的探针1A为针对TOP2A的基因的一条或多条探针；当探针1A为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合；所述的探针1B为针对人类17号染色体着丝粒区域的一条或多条探针；当探针1B为多条探针时，各条探针以相同或不同的摩尔比混合。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述的探针1A可以选自BAC克隆RP11-885J9、BAC克隆RP11-513C18和BAC克隆RP11-38L14中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的探针1B可以选自BAC克隆RP11-25J2、BAC克隆RP11-102E1和BAC克隆RP11-319E24中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)给探针2添加接头的方法为：通过T4DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：许嘉森，吴诗扬，刘志明，朱蓉，
申请(专利权)人：益善生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44