用于检测肝癌的组合物及其用途制造技术

本发明专利技术提供了一种用于检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因靶序列的甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因靶序列为BMP4和RNF135基因。本发明专利技术还提供了包括所述组合物的试剂盒。以及所述组合物在制备体外检测肝癌的试剂盒中的用途。因此本申请提供了一种通过检测样本中的BMP4和RNF135基因靶序列甲基化状态来对肝癌进行体外检测的方法，提供了一种无创的、快速的肝癌筛查方法。

【技术实现步骤摘要】
用于检测肝癌的组合物及其用途
本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测肝癌的组合物及其相应的试剂盒和用途。
技术介绍
我国肝炎患者和长期饮用烈性酒的人群比例较高，导致肝癌成为我国一种高发恶性肿瘤疾病。全国肿瘤防治办公室数据显示：2015年，我国肝癌新发病例46.6万人，死亡42.2万人，位居我国常见癌症的第三位。肝癌的病死率达90％以上，是一种恶性程度很高的癌症。造成肝癌死亡率较高的一个重要因素是早期肝癌的确诊率低。早期肝癌缺乏明显和特异的症状，绝大部分患者确诊时属于晚期。临床研究发现，从肝癌病灶开始形成到患者出现临床症状的过程平均需要几年时间，这为发现早期肝癌、提高早期肝癌的确诊率提供了一个有效的窗口期。充分利用这个窗口期，有望提高肝癌治疗效果、降低肝癌死亡率。目前用于肝癌诊断的技术在早期肝癌的检测和筛查方面的应用有限：1)影像学检测技术(B超、CT、MRI等)设备成本高，操作技术要求强，检测成本高；2)组织活检的侵入性强，不适于早癌筛查的应用和推广；3)血清肿瘤标识物(AFP、CEA、CA125、和CA199等)灵敏度较低，无法充分满足早癌筛查的要求；在肝癌检测方面应用较广的血清标识物AFP具有很好的检测特异性，但是只有60％左右的肝癌患者出现AFP水平上升的现象，也就是说，其灵敏度不能满足当前的需求。近年的研究证明，表观遗传学在癌症的发生、发展中起着重要作用。作为表观遗传学的一种重要机制，多种肿瘤(肠癌、胃癌、肺癌等)的DNA甲基化调控得到了深入研究。研究数据显示：基因甲基化的调控与染色质结构和基因表达调控等生物学机制相关联；细胞基因甲基化的变化发生在肿瘤形成的早期，并贯穿癌症的发生和发展过程；抑癌基因的甲基化是癌前病变组织转化为恶性肿瘤细胞的重要分子机制。但是现有技术中缺乏针对肝癌的甲基化基因的数据。基于此，当前对用于肝癌检测的敏感性高和特异性高的标记物存在需求，理想的肝癌标记物能在肝脏结节恶变的早期阶段即能敏感和特异性地检出。
技术实现思路
基于此，针对现有技术存在的早期肝癌患者检测中检测灵敏度低，检测成本高的问题，本专利技术提供了一种用于检测肝癌的组合物，本专利技术提供的组合物能够灵敏和特异地检测肝癌，本专利技术还提供了包含所述组合物的试剂盒以及其在检测肝癌中的用途，本专利技术提供的试剂盒具有良好的肝癌检测灵敏性，能够方便、快捷、有效地检测胃癌。本专利技术提供了一种用于体外检测肝癌的组合物、试剂盒及其用途，以及基于该试剂盒来执行检测的方法。本专利技术的专利技术人利用表观基因组学和生物信息学技术，通过分析肝癌组织和癌旁对照组织的全基因组甲基化数据，意料之外地发现两个与肝癌相关的甲基化基因，并确定了这两个肝癌甲基化基因发生甲基化异常的靶序列；进一步地，本专利技术的专利技术人发现，通过这两个肝癌甲基化基因的靶序列，能够灵敏和特异地检测这两个基因的甲基化状态，从而可以用于对外周血游离DNA的检测。通过对肝癌患者和正常对照个体的外周血样本的检测显示：本专利技术描述的组合物和检测方法能够灵敏和特异地检测肝癌，并能够有效区分肝癌和肝硬化。因此，本专利技术提供了一种可用于体外检测肝癌的组合物和检测方法，具有重要的临床应用价值。一方面，本专利技术提供了一种用于体外检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的靶序列内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为BMP4基因和RNF135基因。优选地，所述BMP4基因的靶序列如SEQIDNO:1所示；优选地，所述RNF135基因的靶序列如SEQIDNO:2所示；优选地，所述核酸检测的序列包括所述目标基因靶序列中的至少9个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；更优选地，所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQIDNO:1和2的连续序列中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。优选地，所述组合物还包括将目标基因靶序列的5位未甲基化胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶的试剂。更优选地，所述试剂为亚硫酸氢盐。优选地，所述组合物包括如下的引物、探针和/或阻断剂中的一种或多种：BMP4引物FSEQIDNO:3GTGGTATTCGAGTTGAGGGABMP4引物RSEQIDNO:4ACTAAATACTCAACCGAAACABMP4探针SEQIDNO:5CGACGTCTCAAACTCGCGTBMP4阻断剂SEQIDNO:6TTGAGGGATGTGAGTTTGAGATGTTGTTRNF135引物FSEQIDNO:7TCGTTGGGTTTGTTTTATTTGTRNF135引物RSEQIDNO:8GTATTCTTCCGCAAATACGRNF135探针SEQIDNO:9TCGTTAGGGCGTCGCGTAGRNF135阻断剂SEQIDNO:10TGTTTTATTTGTTGTTAGGGTGTTGTGTAGTA。另一方面，本专利技术提供了包括所述组合物的试剂盒。再一方面，本专利技术提供了一种体外检测肝癌的方法，所述方法包括以下步骤：1)分离待测生物样品中的目标基因靶序列或其片段；2)确定所述目标基因靶序列的甲基化状态；3)通过所述目标基因靶序列的甲基化状态的检测结果判断生物样品的状态，从而实现对肝癌的体外检测。根据某些优选实施方式，所述方法还包括以下步骤：1)提取待测生物样品的基因组DNA；2)使用试剂处理步骤1)得到的DNA样品，使5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，即目标基因靶序列的5位未甲基化的胞嘧啶碱基转化为尿嘧啶或其它碱基，转化后的碱基在杂交性能方面不同于5位未甲基化的胞嘧啶碱基，并且是可检测的；3)将经步骤2)处理过的DNA样品与DNA聚合酶和所述目标基因靶序列的引物接触，使得所述经处理的目标基因靶序列被扩增以产生扩增产物或不被扩增；所述经处理的目标基因靶序列如果发生DNA聚合反应，会产生扩增产物；所述经处理的目标基因靶序列如果不发生DNA聚合反应，则不被扩增；4)用探针检测扩增产物；以及5)基于所述扩增产物是否存在，确定所述目标基因靶序列的至少一个CpG二核苷酸的甲基化状态。优选地，典型的引物包括所述目标基因靶序列的片段，所述目标基因靶序列的片段包含分别等同于、互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于选自SEQIDNO:1和2中的至少9个核苷酸的片段或其互补序列。优选地，所述引物、探针和/或阻断剂中的一种或多种如下所示：BMP4引物FSEQIDNO:3GTGGTATTCGAGTTGAGGGABMP4引物RSEQIDNO:4ACTAAATACTCAACCGAAACABMP4探针SEQIDNO:5CGACGTCTCAAACTCGCGTBMP4阻断剂SEQIDNO:6TTGAGGGATGTGAGTTTGAGATGTTGTT。RNF135引物FSEQIDNO:7TCGTTGGGTTTGTTTTATTTGTRNF135引物RSEQIDNO:8GTATTCTTCCGCAAATACGRNF135探针SEQIDNO:9TCGTTAGGGCGTCGCGTAGRNF135阻断剂SEQIDNO:10TGTTTTATTTGTTGTTAGGGTGTTGTGTAGTA。并且，所述接触或扩增包括使用至少一种如下的方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于体外检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的靶序列内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为BMP4基因和RNF135基因。

【技术特征摘要】
1.一种用于体外检测肝癌的组合物，所述组合物包括用于检测目标基因的靶序列内甲基化状态的核酸，其中，所述目标基因为BMP4基因和RNF135基因。2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述BMP4基因的靶序列如SEQIDNO:1所示；优选地，所述RNF135基因的靶序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，所述核酸检测的序列包括所述目标基因靶序列中的至少9个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列；优选地，所述核酸检测的序列分别等同于或互补于或在中等严紧或严紧条件下杂交于SEQIDNO:1和2的连续序列中的至少15个核苷酸的片段，其中所述核苷酸的片段包含至少一个CpG二核苷酸序列。4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中，所述组合物包括如下的引物、探针和/或阻断剂中的一种或多种：BMP4引物FSEQIDNO:3GTGGTATTCGAGTTGAGGGABMP4引物RSEQIDNO:4ACTAAAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：马竣，韩晓亮，王建铭，
申请(专利权)人：博尔诚北京科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11