用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用。所述的分子标志物为外泌体miRNA exo‑miR‑92b‑3p及/或exo‑let7g‑5p，分别如序列表中SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术首次发现，与正常人相比，早期胃癌患者循环血中的exo‑miR‑92b‑3p及exo‑let7g‑5p含量显著升高，较常规的肿瘤标志物CEA指标有更高的灵敏度和特异性。且exo‑miR‑92b‑3p和exo‑let7g‑5p联合或与CEA指标联合后均能够显著提高诊断率，因此，exo‑miR‑92b‑3p及/或exo‑let7g‑5p可作为早期胃癌的可靠循环生物标志物用于早期胃癌诊断。

【技术实现步骤摘要】
用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用
本专利技术涉及一种分子标志物及其应用，特别涉及一种用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用，本专利技术属于医药

技术介绍
众所周知胃癌是常见的严重威胁生命的消化系统恶性肿瘤。根据美国癌症学会的统计，截止至2012年胃癌已成为是全球第五大常见的恶性肿瘤、第三大致死性癌症。2012年全球有近100万例胃癌新增病例、70余万患者死亡。发展中国家男性及女性的胃癌发病率及死亡率均较发达国家更高，目前全球70％的新发病例发生在亚洲的发展中国家，其中的一半主要发生在我国，2015年中国癌症统计数据显示胃癌位居我国癌症发病率及死亡率的第二位。尽管近年来胃癌的发病率有所下降，然而其死亡率仍居高不下，缺乏早期诊断的方法以及容易产生耐药是其高致死率背后的主要原因。晚期胃癌的5年生存率仅为30％-50％，而早期胃癌的5年生存率可达90％以上。胃癌的早期诊断也可以有效地降低患者的死亡率，因此早期诊断对提高胃癌疗效非常重要。胃癌早期诊断一直是人们关注的重点问题，目前传统的胃镜检查仍是胃癌诊断最可靠的手段，然而胃镜检查属侵入性检查，不适宜作为常规筛选检查。目前用于临床的胃癌标志物主要有CEA、CA199、CA724等，但这些指标诊断的灵敏度和特异性均较低，用于临床诊断价值有限。因此，为规避常规诊断的短板，迫切需要一种新的、简便易行的、高敏感及高特异性的非侵入性标志物，来提高胃癌早期甚至是超早期诊断或预后评估。Exosome是来源于细胞内体、经由多管状小体与细胞浆膜融合而释放到细胞外环境中的双层膜性结构，直径在30-100nm，几乎可以由所有种类的细胞分泌，并存在于人体内几乎所有的体液中，如：血浆，血清，唾液，尿液，腹水等。Exosome能够作为一种“运输工具”，在细胞间转运蛋白质和RNA参与许多细胞内过程，介导癌症进展、肿瘤微环境改变、血管生成、免疫反应调节、转移和耐药等。血液是exosome在循环系统中的重要分布地点，血清exosome被证实是循环系统中miRNA的主要来源。在exosome的双层膜结构的保护下，血液中大量存在的RNA酶被充分隔离，使得miRNA免于被降解而保持稳定；另外，有了exosome的保护，物理因素如冻融所导致的血液中RNA含量的波动不会影响其在exosome中的水平，即使miRNA被转移到远离原始细胞的位置时也仍能保持其原有的功能。相比于血液中总miRNA的弱稳定状态，exosomemiRNAs稳定性更强，即使是在长期冻存的样本中也能方便的提取；另外，exosomes中的miRNAs还有选择性富集和特异的特点。本专利技术首次发现，与正常人相比，早期胃癌患者循环血中的exo-miR-92b-3p及exo-let7g-5p含量显著升高，较常规的肿瘤标志物--CEA指标有更高的诊断效率。且exo-miR-92b-3p和exo-let7g-5p的联合及其联合CEA指标后均能够显著提高诊断率，exo-miR-92b-3p及exo-let7g-5p是早期胃癌的可靠循环生物标志物。
技术实现思路
针对现有用于早期胃癌诊断的分子标志物诊断阳性率、灵敏度和特异性均较低的问题，本专利技术提出了一种用于早期胃癌诊断的分子标志物及其应用。为了达到上述目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术提出了一种用于早期胃癌诊断的分子标志物，该子标志物为外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p，其中exo-miR-92b-3p的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，exo-let7g-5p的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。进一步的，本专利技术还提出了所述的分子标志物以及用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p表达水平的试剂用于制备用于诊断早期胃癌的试剂盒中的应用。其中，优选的，所述的试剂为引物，更优选的，用于外泌体miRNAexo-miR-92b-3p表达水平检测的上游引物为如序列表中SEQIDNO：3所示，用于外泌体exo-let7g-5p表达水平检测的上游引物为如序列表中SEQIDNO：4所示，下游引物均为通用引物。其中，优选的，所述的通用引物为miScriptUniversalPrimer。更进一步的，本专利技术还提出了一种用于诊断早期胃癌的试剂盒，所述试剂盒中含有用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p表达水平的引物，优选的，用于外泌体miRNAexo-miR-92b-3p表达水平检测的上游引物如序列表中SEQIDNO：3所示，用于外泌体exo-let7g-5p表达水平检测的上游引物如序列表中SEQIDNO：4所示，下游引物均为通用引物。其中，优选的，所述的通用引物为miScriptUniversalPrimer。其中，优选的，所述的试剂盒中还含有真空采血管-分离胶/促凝剂管、真空采血针组件、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂以及用于检测内参hsa-miR-30e-5p表达水平的引物，其中上游引物如序列表中SEQIDNO：5所示，下游引物为通用引物。其中，优选的，使用本专利技术所述的试剂盒用于早期胃癌诊断时，按照以下步骤进行：(1)血清exosome分离及其RNA提取采用外泌体分离试剂分离血清中的exosomes，再用外泌体miRNA提取试剂提取exosomes中的小RNA；(2)外泌体RNA逆转录成cDNA采用反转录试剂将外泌体RNA逆转录成cDNA；(3)PCR扩增cDNA以逆转录成的cDNA为模板，采用实时荧光定量PCR试剂按照以下方法中的任一种进行PCR扩增；1)采用用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及内参hsa-miR-30e-5p的引物进行扩增；2)采用用于检测外泌体miRNAhsa-let7g-5p及内参hsa-miR-30e-5p的引物进行扩增；3)采用用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p、hsa-let7g-5p及内参hsa-miR-30e-5p的引物进行联合扩增；(4)结果判定：荧光定量检测结果分析：以hsa-miR-30e-5p的表达量为参照，计算miRNA表达量时，miRNA的相对定量以ΔCt值显示，ΔCt＝Ct(miRNA)-Ct(hsa-miR-30e-5p)，其中在方法1)中，将hsa-miR-92b-3p的相对表达量ΔCt＜1.690判定为表达阳性，反之为表达阴性；表达阳性者诊断为胃癌；方法2)中，将hsa-let7g-5p的相对表达量ΔCt＜4.184判定为表达阳性，反之为表达阴性；表达阳性者诊断为胃癌；方法3)中，将hsa-miR-92b-3p的相对表达量ΔCt＜1.690、hsa-let7g-5p的相对表达量ΔCt＜4.184判定为表达阳性，反之为阴性；当hsa-miR-92b-3p及hsa-let7g-5p任一指标表达阳性时，诊断为早期胃癌。相较于现有技术，本专利技术的有益效果：本专利技术首次发现，与正常人相比，早期胃癌患者循环血中的exo-miR-92b-3p及exo-let7g-5p含量显著升高，较常规的肿瘤标志物--CEA指标有更高的诊断效率，且exo-miR-9本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于早期胃癌诊断的分子标志物，其特征在于该子标志物为外泌体miRNA exo‑miR‑92b‑3p及/或exo‑let7g‑5p，其中exo‑miR‑92b‑3p的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示，exo‑let7g‑5p的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.用于早期胃癌诊断的分子标志物，其特征在于该子标志物为外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p，其中exo-miR-92b-3p的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：1所示，exo-let7g-5p的核苷酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示。2.权利要求1所述的分子标志物用于制备用于诊断早期胃癌的试剂盒中的应用。3.用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p表达水平的试剂在制备用于诊断早期胃癌的试剂盒中的应用。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂为引物，优选的，用于外泌体miRNAexo-miR-92b-3p表达水平检测的上游引物为如序列表中SEQIDNO：3所示，用于外泌体exo-let7g-5p表达水平检测的上游引物为如序列表中SEQIDNO：4所示，下游引物均为通用引物。5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的通用引物为miScriptUniversalPrimer。6.一种用于诊断早期胃癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有用于检测外泌体miRNAexo-miR-92b-3p及/或exo-let7g-5p表达水平的引物，优选的，用于外泌体miRNAexo-miR-92b-3p表达水平检测的上游引物如序列表中SEQIDNO：3所示，用于外泌体exo-let7g-5p表达水平检测的上游引物如序列表中SEQIDNO：4所示，下游引物均为通用引物。7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的通用引物为miScriptUniversalPrimer。8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还含有真空采血管-分离胶/促凝剂管、真空采血针组件、外泌体分离试剂、外泌体miRNA提取试剂、反转录试剂、实时荧光定量PCR试剂以及用于检测内参hsa-miR-30e...

【专利技术属性】
技术研发人员：张艳桥，黄小义，唐淑丽，程佳楠，姚媛菲，
申请(专利权)人：哈尔滨医科大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23