本发明专利技术公开了一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用，属于生物工程领域。本发明专利技术是利用PCR技术将Lactobacillus plantarum中的亚硝酸盐还原酶基因进行克隆并在大肠杆菌中进行诱导表达，利用亲和层析作用纯化得到高纯度的重组蛋白。利用本发明专利技术的方法纯化得到的高纯度的蛋白质可以有效的降解食品中的亚硝酸盐，并可以用于对其结构及性质的研究。
【技术实现步骤摘要】
一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组载体、用该载体转化的宿主以及利用该转化体大量表达亚硝酸盐还原酶、和亚硝酸盐还原酶的高效亲和层析纯化方法。
技术介绍
亚硝酸盐是一种潜在的致癌物质，在蔬菜发酵过程中极易积累，给产品带来潜在的个品安全问题，且过量摄入亚硝酸盐可诱发高铁血红蛋白症，因此严格控制食品中亚硝酸盐的含量非常重要。许多研究表明亚硝酸盐是亚硝胺的前体物，亚硝胺是一种强致癌物，可以诱发消化系统中的多种癌变，如胃癌、肠癌和肝癌。鉴于食品可能存在超标亚硝酸盐污染和肉制品中含有亚硝酸盐的潜在食品安全问题，寻求有效控制或降解亚硝酸盐的方法势在必行，除了加入食用安全的乳酸菌外，还可利用亚硝酸盐还原酶(NiR)进行亚硝酸盐的生物降解。但是，目前对如何得到大量的食用安全的亚硝酸盐还原酶还没有很好的方法。主要是因为酶蛋白质的分离纯化困难导致生产成本过高而无法实现产业化，与常规蛋白分离技术相比，固定金属离子亲和层析技术(Imobilizedmetalionaffinitychromatography，简称IMAC)用于酶蛋白之分离，选择性高，能实现高通量、高吸附的分离纯化。分离的原理主要利用蛋白质表面的组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等和固定金属离子发生亲和作用实现酶蛋白质的分离。因此，设计聚组氨酸、色氨酸、半胱氨酸、精氨酸等为亲和标签与目的酶蛋白质融合后再用IMAC进行纯化，可达到预期的分离效果。国内外从乳酸菌中提取亚硝酸盐还原酶和大量表达报道很少，现有技术中利用简单的机械破碎和离心的方法收集粗酶，由于粗酶液中含有大量的杂蛋白，使得后续的分离和纯化工作复杂，无法大量得到目标产物亚硝酸盐还原酶。申请号为201210037774.2的中国专利技术专利公开了“一种植物乳杆菌的亚硝酸盐还原酶基因及其编码的蛋白质和应用”，其中验证亚硝酸盐还原酶是否表达成功主要的依据为重组微生物的全蛋白SDS-PAGE电泳结果，没有进一步深入该重组蛋白的分离纯化、酶活和应用，由于微生物工程菌E.coliBL21、E.coliDE3和JM105在转化前都能表达亚硝酸盐还原酶，通过以上专利技术的方法，无法很好鉴别亚硝酸盐还原酶的表达是否成功。
技术实现思路
为解决现有亚硝酸盐还原酶的大量表达、提取和纯化等方面的不足，本专利技术提供了—种亚硝酸盐还原酶编码基因重组方法，并提供了一种亚硝酸盐重组蛋白的大量表达和纯化的方法，主要是利用含组氨酸标签(His标签)的原核表达载体pET-28a(+)，进行亚硝酸盐还原酶基因的重组，再将重组载体转化到宿主，并利用转化体进行大量表达亚硝酸盐还原酶，利用亲和层析法进行纯化亚硝酸盐蛋白。为了实现上述目的，本专利技术采用了如下技术方案：一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。含有植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因的重组质粒中含组氨酸标签。一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。上述还原酶基因编码的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：(1)以NCBI中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶编码基因为模板，进行上下游引物设计，设计的酶切位点为NcoI、XhoI；(2)Lactobacillusplantarum在37℃培养16h后的菌液，提取其DNA，并以此为模板，通过PCR技术扩增植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因片段(如SEQIDNO.1所示)；(3)利用NcoI、XhoI工具酶将扩增片段和质粒pET-28a(+)于4℃下分别切成具有两个粘性末端的片段；采用回收试剂盒回收以上两个片段，并用T4DNA连接酶连接，再转入重组大肠杆菌中，利用抗生素卡纳霉素进行筛选即可获得阳性工程菌；(4)将上述工程菌经诱导表达，采用亲和层析法纯化，即得到重组亚硝酸盐还原酶。所属重组大肠杆菌为E.coliDH5α或E.coliBL21。步骤(1)中所述上游引物为5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(NcoI)，下游引物为5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)。所述诱导表达为加入诱导剂IPTG进行诱导，IPTG的浓度为1mmol/L。所述亲和层析法为Nisepharose亲和层析法。所制备的亚硝酸盐还原酶活性测定时，需在500μL反应体系中加入15μL0.1mol/L电子供体甲基紫精，NiR活性测定采用Na2S2O4-MV法。本专利技术制备得到的蛋白质，可以有效的降解食品中的亚硝酸盐，并可以用于对其结构及性质的研究。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：(1)本专利技术通过亲和层析作用来验证工程菌可以诱导表达亚硝酸盐还原酶(NiR)重组蛋白。(2)本专利技术可以通过IPTG诱导表达得到大量的亚硝酸盐还原酶，可以应用到工业中大量生产亚硝酸盐还原酶。(3)本专利技术利用亲和层析作用纯化得到纯度较高的NiR重组蛋白，解决了从植物乳杆菌中分离出纯度较高亚硝酸盐还原酶的难题。(4)本专利技术得到的工程菌表达的重组蛋白可以有效的降解亚硝酸盐，可以生产成酶制剂，能有效降解食品中的亚硝酸盐；还可作为抗原用于植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶抗体的制备，并可以用于对其结构及性质方面的研究。附图说明图1为实施例1中利用Lactobacillusplantarum基因组DNA为模板进行PCR扩增产物鉴定图，其中M为DNA分子量；1～5为PCR扩增产物。图2为实施例2中构建的重组质粒进行双酶切鉴定图，其中M为DNA分子量；1为pET28a-nir被NcoI、XhoI产物；2为质粒pET28a-nir。图3为实施例3中诱导含有重组质粒pET28a-nir的E.coliBL21后的电泳检测结果。M表示蛋白质marker；1为pET28a沉淀；2为pET28a上清；3为未诱导pET28a/BL21(DE3)沉淀；4为未诱导pET28a/BL21(DE3)上清；5为诱导pET28a-nir/BL21(DE3)上清；6为诱导pET28a-nir/BL21(DE3)沉淀。图4为实施例4中纯化后的NiR的蛋白质的SDS-PAGE电泳图，其中M为蛋白质marker；1-4为Ni2+柱的80mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、300mmol/L咪唑溶液洗脱液。图5为实施例5中酶学性质测定，pH对酶活性的影响趋势图，其中a为重组NiR的最适pH，b为酶的pH稳定性。图6为实施例5中酶学性质测定，温度对酶活性的影响趋势图，其中a为重组NiR的最适温度，b为酶的热稳定性。具体实施方案下面结合实施例对本专利技术作进一步详细说明，但是本专利技术要求保护范围并不局限于此。实施例1植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的制备，包括如下步骤：1、PCR引物设计以Genbank中物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的DNA设计出PCR引物：上游引物(SEQIDNO.3)为5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(NcoI)，下游引物(SEQIDNO.4)为5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)，并人工合成这对上下游引物；2、植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的提取(细菌基因组DNA小量纯化试剂盒TakaraMinibestBact本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其特征在于，其核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。2.权利要求1所述基因编码的蛋白质。3.根据权利要求2所述的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体为pET-28a(+)。6.含有权利要求1所述基因的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌细胞。7.根据权利要求1所述的一种植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶基因，其特征在于，所述的还原酶基因编码的蛋白质的制备方法，包括如下步骤：(1)植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的制备1)以Genbank中植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的DNA设计出PCR引物：上游引物(SEQIDNO.3)为5-CTCGAGAAAAGACCATGGCCAA-3(NcoI)，下游引物(SEQIDNO.4)为5-CTTAAGAATCCTGTTTGGAC-3(XhoI)，并人工合成这对上下游引物；2)植物乳杆菌亚硝酸盐还原酶的基因组DNA的提取；3)目的基因的扩增；(2)重组表达载体pET28a(+)-nir的构建(3)构建好的表达载体pET28a(+)-nir质粒，转入E.coliBL21感受态细胞中，获得重组大肠杆菌进行诱导表达将构建好的表达菌株接种到LB/Kan液体培养基中，37℃振荡过夜培养14h，然后分别按1％的菌液量接种于含有100mLLB/Kan液体培养基的三角瓶中，37℃振荡培养4h，加入IPTG使最终浓度为1mmol/L；将菌液8000r/min离心10min，弃去上清液，沉淀菌体用pH7.4PBS缓冲液洗涤两次，将洗涤后的菌体重悬于10mL预冷的...
【专利技术属性】
技术研发人员：张庆芳，李美玉，迟乃玉，王晓辉，于爽，胡善松，
申请(专利权)人：大连大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。