一种微球试剂的制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种微球试剂的制备方法和应用，通过改变实验操作顺序，调整抗体、微球和活化剂的稀释混合步骤，针对完整体系优化助剂、稳定剂、贮存剂等添加剂的配方和浓度，各步骤各条件相互配合，协同增效，最终使得体系分散均匀，稳定保持，无需进行反复离心和过滤的过程，大大简化试验工艺，降低工艺难度，且解决传统工艺批量小的问题，有效降低生产成本，提高企业生产效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

【技术实现步骤摘要】
一种微球试剂的制备方法和应用
本专利技术属于生物
，涉及一种微球试剂的制备方法和应用。
技术介绍
胱抑素C，是一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，也被称为γ-微量蛋白或γ-后球蛋白，且是一种低分子量、碱性非糖化蛋白质，其分子量为13.3KD，由122个氨基酸残基组成，可由机体所有有核细胞产生，产生率恒定。循环中的胱抑素C仅经肾小球滤过而被清除，为反映肾小球滤过率变化的内源性标志物，并在近曲小管重吸收，但重吸收后被完全代谢分解，不返回血液。因此，可以通过血液中胱抑素C的浓度来反映肾小球的过滤速率。而且，胱抑素C血清浓度不受敏症过程、性别、年龄和肌肉重量影响，是反映肾小球滤过率变化的理想同源性标志物，并逐步发展为评估肾功能的一项敏感性好、特异性高的指标。免疫胶乳浊度测定法，是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的-种非放射性均相免疫浊度测定法，其基本原理是：将抗体吸附在大小适中、均匀一致的胶乳颗粒上，当遇到相应抗原时，则使胶乳颗粒发生凝集。单个胶乳颗粒在入射光波之内不阻碍光线透过，两个或两个以上胶乳颗粒凝聚时则使透过光减少，这种减少的程度与胶乳颗粒凝聚的程度呈正比，当然也与待测抗原量呈正比，由此可测出标本中待测物的含量。胶乳颗粒增强透射免疫比浊法即PETIA，是一种间接凝集试验，其原理是包被了抗原或抗体的胶乳颗粒即免疫胶乳，与标本中相应的抗体或抗原发生免疫后，形成凝集颗粒，凝集物的形成使体系中产生一定的浊度，且与目的检测物的浓度成正相关，测定特定波长下反应体系得浊度，通过标准曲线(该曲线为标准物浓度与浊度关系曲线)即可测出目的检测物的浓度。该技术的关键在于两个方面:首先是选择适用的胶乳，其大小(直径)要稍小于波长，用500nm波长者，选择100nm颗粒较适合；用585nm波长者，则选用100-200nm颗粒为好；其次是采用合适的方法将聚苯乙烯胶乳包被目的抗体，常有的包被方法有物理吸附法和化学交联法。传统胱抑素C检测试剂盒R2试剂主要采用多步法制备，涉及多次离心、过滤工艺，其耗时长、工艺繁锁，且受设备、人员、场地等多种因素限制，单批次制备量少、损耗大、生产成本高。CN106932594A提供一种胱抑素C检测试剂盒及其制备方法，所述试剂盒包括彼此独立的试剂R1和试剂R2，所述试剂R1主要由缓冲液1、无机盐离子1、稳定剂1、防腐剂1、增溶剂1和加速剂1组成；所述试剂R2主要由交联胱抑素C抗体的聚苯乙烯微球、缓冲液2、稳定剂2、增溶剂2、防腐剂2和保护剂2组成，所述聚苯乙烯微球与胱抑素C抗体通过物理吸附或者化学交联连接，并被β环糊精包合。CN101377492B公开一种检测血清或血浆中胱抑素C的胶乳增强型免疫比浊试剂盒。该试剂盒采用胶乳包被的抗胱抑素C的抗体，与待测胱抑素C发生连锁反应，胶乳通过免疫反应一层一层聚集形成不溶性免疫颗粒复合物，胶乳的粒径发生改变引起浊度明显变化，用光透射强度(570nm)或光散射强度检测该变化，从用已知浓度胱抑素C标准品做出的标准曲线得出样本中目标检测物胱抑素C的浓度。该专利技术所述试剂盒包含试剂R1，试剂R2，胱抑素C标准品。但上述现有技术的试剂R2的制备和使用方法繁琐复杂，生产成本高，有待进一步提高。因此，研发一种高效简洁，稳定低成本的制备微球试剂R2的方法，提高，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足及实际的需求，本专利技术提供一种微球试剂的制备方法和应用，采用一步法制备胱抑素C-R2试剂，基于微球、抗体及活化剂的相互作用制备胶乳，混匀超声使得体系分散，优化添加助剂使得体系稳定保存，简化试验工艺，降低工艺难度，有效降低生产成本，提高企业生产效率。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供一种微球试剂的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)混合：将微球溶液A和胱抑素抗体溶液B混合，得到混合液C；(2)偶联活化：将微球活化剂溶液D与助剂a加入混合液C中进行偶联反应，得到混合液E后进行水浴超声分散；(3)封闭：将混合液E进行封闭处理，得到混合液F后进行水浴超声分散；(4)稀释：将混合液F进行稀释，得到混合液G并水浴超声分散，得到所述微球试剂，即胱抑素C检测试剂R2；其中，所述助剂a的成分包括：pH为4.0-7.0的10-150mM的缓冲液，质量分数为0-1％的无机盐，浓度为0-1g/L的防腐剂和质量分数0-1％的悬浊剂。本专利技术中，专利技术人在长期的科研实践过程中，深入调研传统胱抑素C检测试剂盒R2试剂的优缺点，总结发现主要采用多步法制备，涉及多次离心、过滤工艺，其耗时长、工艺繁锁，且受设备、人员、场地等多种因素限制，单批次制备量少、损耗大、生产成本高；为解决上述问题，本专利技术采用一步法制备胱抑素C-R2试剂，基于微球、抗体及活化剂的相互作用制备胶乳，稀释后微球先与稀释后抗体相混合，再分别以活化剂对其活化，以封闭剂对其封闭，以稀释液对其稀释，最终得CYS-CR2试剂；通过混匀仪、超声仪等使所得胶乳处于分散体系状态，再结合稳定剂、防腐剂、贮存剂的相互配合使所得体系稳定保存。本专利技术提供的方法通过改变实验操作顺序，调整抗体、微球和活化剂的稀释混合步骤，针对完整体系优化助剂、稳定剂、贮存剂等添加剂的配方和浓度，各步骤各条件相互配合，协同增效，最终使得体系分散均匀，稳定保持，无需进行反复离心和过滤的过程，大大简化试验工艺，降低工艺难度，且解决传统工艺批量小的问题，有效降低生产成本，提高企业生产效率，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。优选地，步骤(1)所述混合液C的微球浓度为20-30％，抗体浓度为30-40％。优选地，步骤(1)所述微球为聚苯乙烯微球。优选地，步骤(1)所述微球的粒径为50-200nm，例如可以是50nm、80nm、100nm、120nm、140nm、160nm、180nm或200nm。优选地，步骤(1)所述微球的表面修饰基团为羧基。优选地，步骤(1)所述微球溶液A为微球溶于助剂a得到。优选地，步骤(1)所述胱抑素抗体溶液B为胱抑素抗体溶于助剂a得到。其中，所述助剂a的无机盐的质量分数例如可以是0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％或1％。优选地，所述助剂a的缓冲液包括MES、MOPSO或PBS中的任意一种或至少两种的组合。优选地，所述无机盐包括KCl和/或NaCl。优选地，所述助剂a的防腐剂的浓度例如可以是0g/L、0.2g/L、0.4g/L、0.6g/L、0.8g/L或1g/L。优选地，所述助剂a的防腐剂包括Proclin300和/或NaN3。优选地，所述助剂a的悬浊剂的质量分数例如可以是0％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％或1％。优选地，所述助剂a的悬浊剂包括海藻糖、蔗糖或PEG中的任意一种或至少两种的组合。优选地，步骤(1)所述混合的时间为5-30min，例如可以是5min、10min、15min、20min、25min或30min。优选地，步骤(1)所述混合的转速为30-50rmp，例如可以是30rmp、35rmp、40rmp、45rmp或50rmp。优选地，步骤(1)所述混合的环境为室温阴凉处。优选地，所述混合液C中的微球浓度例如可以是20％、22％、24％、26％、28％或30％。优选地，所述混合液C中的抗体浓度例如可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种微球试剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)混合：将微球溶液A和胱抑素抗体溶液B混合，得到混合液C；(2)活化偶联：将微球活化剂溶液D与助剂a加入混合液C中进行偶联反应，得到混合液E后进行水浴超声分散；(3)封闭：将混合液E进行封闭处理，得到混合液F后进行水浴超声分散；(4)稀释：将混合液F进行稀释，得到混合液G并水浴超声分散，得到所述微球试剂，即胱抑素C检测试剂R2；其中，所述助剂a的成分包括：pH为4.0‑7.0的10‑150mM的缓冲液，质量分数为0‑1％的无机盐，浓度为0‑1g/L的防腐剂和质量分数0‑1％的悬浊剂。

【技术特征摘要】
1.一种微球试剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)混合：将微球溶液A和胱抑素抗体溶液B混合，得到混合液C；(2)活化偶联：将微球活化剂溶液D与助剂a加入混合液C中进行偶联反应，得到混合液E后进行水浴超声分散；(3)封闭：将混合液E进行封闭处理，得到混合液F后进行水浴超声分散；(4)稀释：将混合液F进行稀释，得到混合液G并水浴超声分散，得到所述微球试剂，即胱抑素C检测试剂R2；其中，所述助剂a的成分包括：pH为4.0-7.0的10-150mM的缓冲液，质量分数为0-1％的无机盐，浓度为0-1g/L的防腐剂和质量分数0-1％的悬浊剂。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述混合液C的微球浓度为20-30％，抗体浓度为30-40％；优选地，步骤(1)所述微球为聚苯乙烯微球；优选地，步骤(1)所述微球的粒径为50-200nm；优选地，步骤(1)所述微球的表面修饰基团为羧基；优选地，步骤(1)所述微球溶液A为微球溶于助剂a得到；优选地，步骤(1)所述胱抑素抗体溶液B为胱抑素抗体溶于助剂a得到；优选地，步骤(1)所述混合的时间为5-30min；优选地，步骤(1)所述混合的转速为30-50rmp；优选地，步骤(1)所述混合的环境为室温阴凉处。3.根据权利要求1或2所说的方法，其特征在于，步骤(2)所述混合液C的体积为微球活化剂溶液D与助剂a的体积和的2-4倍；优选地，步骤(2)所述微球活化剂溶液D的浓度为4-20mg/mL；优选地，步骤(2)所述微球活化剂溶液D为微球活化剂溶于助剂a得到；优选地，步骤(2)所述微球活化剂溶液D与助剂a的体积比为1:(8-12)；优选地，步骤(2)所述偶联的时间为1-3h；优选地，步骤(2)所述水浴的温度为15-37℃；优选地，步骤(2)所述超声的功率为20-100％，时间为1-3s，间隔为3-6s，超声总时间为1-200min。4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述封闭的方法为：将助剂b和助剂c按照(2-4):(1-3)的体积比加入混合液E中进行封闭；优选地，所述助剂b的成分包括：pH为5.0-7.5的10-150mM的缓冲液，质量分数不大于1％的无机盐，浓度不大于1g/L的防腐剂，质量分数不大于1％的悬浊剂和质量分数5-20％的稳定剂；优选地，所述助剂c的成分包括：pH为5.0-7.5的10-150mM的缓冲液，质量分数不大于1％的无机盐，浓度不大于1g/L的防腐剂，质量分数不大于1％的悬浊剂，质量分数5-20％的稳定剂和质量分数1-10％表面活性剂。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述封闭的时间为1-5h；优选地，步骤(3)所述超声的功率为20-100％，时间为1-3s，间隔为3-6s，超声总时间为1-200min；优选地，步骤(3)所述水浴的温度为15-37℃。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述稀释的方法为：将助剂d加入混合液F中进行稀释；优选地，所述助剂d的成分包括：pH为6.0-9.5的50-200mM的缓冲液，质量分数0.01-1％的无机盐，质量分数0.1-5％的悬浊剂，0.1-1g/L的防腐剂，质量分数0.1-5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：李子樵，莫春燕，张睿捷，
申请(专利权)人：蓝怡科技集团股份有限公司，浙江蓝怡医药有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31