一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒及其制备方法，由如下组分组成：包被有HBsAg的磁性微球、HBsAb校准品、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合，既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长，检测结果较慢的弊端，大大缩短反应时间，同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体，因磁性微球立体的特性，大大增加免疫反应的接触表面积，从而大大缩短检测时间，并且本发明专利技术对于传统的两步法检测作了进一步优化，检测抗‑HBs只需一步法检测，30分钟内即可检出结果。

【技术实现步骤摘要】
一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒及其制备方法
本专利技术涉及一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒及其制备方法，具体涉及一种基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒的制备方法。
技术介绍
乙型肝炎（简称乙肝）是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的能导致肝性炎症及肝功能损害的一种传染性疾病。抗-HBs是一种保护性抗体，在急性感染后期，HBsAg转阴后一段时间开始出现，在6至12个月内逐步上升至高峰，可持续多年，但浓度会逐步下降；抗-HBs的定量测定对乙肝疫苗免疫力的评价和高危人群预防免疫具有重要意义。目前乙肝病毒血清学检查项目一般包括HBsAg、Anti-HBs、HBeAg、Anti-HBe、Anti-HBc，即俗称的“乙肝两对半”。现主流抗-HBs的检测方法有酶联免疫（ELISA）、胶体金法、化学发光（CLIA）、电化学发光（ECL）、时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）等。ELISA作为半定量检测方法是现应用最广的检测方法，但其灵敏度、线性宽度范围均未达到较高水平，难以适应市场发展的需求。胶体金法与ELISA均有相同的缺点。而CLIA及ECL虽灵敏度高但均存在检测设备造价高昂，而相应的标记物研发门槛高，短时期内国内均会受制于人的缺点同样也限制了在国内的推广。而时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）灵敏度能达到CLIA一致的水平，不仅检测设备造价较低，并且标记技术在国内已相当成熟、检测成本低兼。而传统时间分辨检测，仍以空白酶标板的物理吸附为主，检测过程耗时长。缩短反应时间，降低检测成本，提高检测灵敏度及线性范围，将具有不错的市场前景。专利技术内容基于此，本专利技术的目的在于克服现有技术及相关技术检测费用高昂的缺点，提供一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，及所述试剂盒的制备方法。为实现上述目的，本专利技术采取如下技术方案：一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，由如下组分组成：包被有HBsAg的磁性微球、HBsAb校准品、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、浓缩洗液（清洗液）和增强液、RFID卡。优选地，所述的包被有HBsAg的磁性微球中的磁性微球是将微米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性的、能够与免疫性抗原或抗体相结合的微米级的微球，即通称为“磁珠”。磁性微球应能满足直径为0.1～5μm，磁性微球通过表面修饰可带有多种活性功能基团，包括但不限于羟基（-OH）、氨基（-NH2）、羧基(-COOH)。优选地，所述的包被有HBsAg的磁性微球是采用以下步骤制备而成的：将HBsAg经2～8℃超速冷冻离心机将缓冲体系置换处理后，与清洗、活化后的磁性微球混合并恒温孵育，孵育后清洗磁珠丢弃上清液，然后用磁珠封闭液进行封闭，清洗磁珠再次丢弃上清液，将包被有HBsAg的磁性微球在磁珠保存液中2～8℃冰箱中直立保存。所述磁性微球的活化中EDC及Sulfo-NHS每毫克磁性微球优选地加样质量为10μg～1000μg。活化方式包括但不限于EDC、Sulfo-NHS其中的一种和两种。优选地，所述的与镧系元素结合的HBsAg标记物其中的镧系元素与HBsAg结合是通过中间螯合剂完成，镧系元素包括但不限于铕（EU）、钐（Sm）,螯合剂包括但不限于异硫氰酸苯基-EDTA、异硫氰酸苯甲基-DTTA、P-异硫氰基苄基-DTTA、二乙烯三胺五醋酸氨基苯基-EDTA。本专利技术还提供一种采用上述试剂盒检测抗-HBs的方法,所述方法包括如下步骤：（1）用分析缓冲液将标记物稀释至工作液；（2）用纯化水将浓缩洗液稀释至工作液；（3）将稀释好的工作浓度的磁性微球加于反应杯内；（4）将待检样本或校准品加于上述反应杯内；（5）将（1）中稀释好的标记物工作液加入反应杯内；（6）反应杯在室温下孵育；（7）用（2）中的清洗工作液加磁后洗涤反应杯内的磁性微球；（8）洗涤后，去磁，加入增强液孵育；（9）孵育结束后，进行对应波长的荧光采集检测并分析。优选地，本专利技术为了更进一步减少人工操作步骤，配合公司自研自产的SmartTRF全系列免疫荧光检测设备，将本专利技术检测方法的相应参数、操作步骤均悉数拷贝至RFID卡中。实际操作过程中，只需要将RFID卡与上述免疫荧光检测设备适配即可全自动完成上述实验的操作步骤。RFID（RadioFrequencyIdentification）技术，又称无线射频识别，是一种通信技术，可通过无线电讯号识别特定目标并读写相关数据，而无需识别系统与特定目标之间建立机械或光学接触。本专利技术还提供一种检测HBsAg试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：（1）制备包被有HBsAg的磁性微球；（2）制备与镧系元素结合的HBsAg标记物；（3）制备校准品；（4）制备分析缓冲液、浓缩洗液和增强液；（5）将各组份分别分装至相应的存储容器中；（6）RFID卡复制拷贝；（7）喷码、贴标签；（8）组装成成品试剂盒。与现有技术相比，本专利技术有益效果在于：本方法基于磁性微球与时间分辨免疫分析法相结合，既克服了酶标板物理性吸附反应时间较长，检测结果较慢的弊端，大大缩短反应时间，同时也具备时间分辨检测技术准确性高、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、检测稳定且方便的优点。磁性微球包被相应的抗原或抗体，因磁性微球立体的特性，大大增加免疫反应的接触表面积，从而大大缩短检测时间，并且本专利技术对于传统的两步法检测作了进一步优化，检测抗-HBs只需一步法检测，30分钟内即可检出结果。另外，由于磁性微球的流体特性，不再受限于传统酶标板的框架限制，在任意的反应杯及小试管内即可完成检测，同时能减小检测仪器设备的体积大小及设备成本以满足二、三线城市的全自动化检测需求，亦能如酶标板、化学反光检测一样进行大通量检测，满足一线城市的全自动化检测需求。附图说明图1为采用本专利技术所述检测试剂盒用来储存包被有HBsAg的磁性微球、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的俯视示意图。图2为采用本专利技术所述检测试剂盒用来储存包被有HBsAg的磁性微球、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、清洗液和增强液的试剂条的立体结构标意图示意图。具体实施方式以下结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，更好地说明本专利技术的技术特点、技术方案。以下实施例并不对本专利技术造成任何限制。以下实施例中磁性微球来源于GE公司；铕标记购于芬兰Wallac公司；乙型肝炎病毒表面抗体国家参考品由中国食品药品检定研究院提供；对照试剂盒为雅培乙型肝炎病毒表面抗体测定试剂盒(化学发光微粒子免疫检测法)。实施例1一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，所述试剂盒包括：包被有HBsAg的磁性微球、HBsAb校准品、铕标记的HBsAg标记物、分析缓冲液、浓缩洗液和增强液、RFID卡。本专利技术还提供上述检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒的制备方法，所述方法包括如下步骤：(1)制备包被有HBsAg的磁性微球：将HBsAg经2～8℃超速冷冻离心机将缓冲体系置换处理后，与清洗、活化后的直径1μm～５μm羧基磁性微球混合并恒温孵育１８±2小时，孵育后使用磁珠清洗液清洗磁珠并丢弃上清液，然后用磁珠封闭液进行封闭，清洗磁珠再次丢弃上清液，将包被好的HBsAg磁性微球在磁珠保存液中2～8℃冰箱中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，其特征在于由如下组分组成：包被有HBsAg的磁性微球、HBsAb校准品、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。

【技术特征摘要】
1.一种检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，其特征在于由如下组分组成：包被有HBsAg的磁性微球、HBsAb校准品、与镧系元素结合的HBsAg标记物、分析缓冲液、清洗液、增强液和RFID卡。2.如权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，其特征在于所述的包被有HBsAg的磁性微球中的磁性微球是将微米级的Fe2O3或Fe3O4磁性粒子和有机高分子材料进行复合，形成具有超顺磁性的、能够与免疫性抗原或抗体相结合的微米级的微球。3.如权利要求2所述的检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，其特征在于，磁性微球的直径为0.1～5μm，磁性微球通过表面修饰带有多种活性功能基团，包括但不限于羟基、氨基或羧基。4.如权利要求1所述的检测乙型肝炎病毒表面抗体试剂盒，其特征在于，所述的包被有HBsAg的磁性微球是采用以下步骤制备而成的：将HBsAg经2～8℃超速冷冻离心机将缓冲体系置换处理后，与清洗、活化后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李根平，
申请(专利权)人：广州源起健康科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44