样品中多核苷酸序列的分数丰度制造技术

本文公开了用于使用纳米孔传感器确定样品中的目标分析物(例如，特定多核苷酸序列)的真实分数丰度的改进估计值的方法和组合物，例如，通过校正鉴定电信号和将电信号与样品中的目标分析物或参照分析物的量相关联所固有的误差。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】样品中多核苷酸序列的分数丰度相关申请的交叉引用本申请要求2016年10月24日提交的美国临时申请No.62/412,221和2017年3月31日提交的国际申请No.PCT/US2017/025585的权益，其内容均通过引用完整并入本文。
一种使用固态纳米孔和用于精确和准确定量的数学方法从样品确定特定多核苷酸序列的分数丰度的方法。
技术介绍
通过确定样品中存在的组分的相对丰度来表征液体样品可以为许多科学领域和应用提供有价值的信息。例如，循环细胞游离DNA中点突变的相对丰度可用于诊断或监测患者中癌症的进展。作为另一个实例，确定遗传修饰生物(GMO)的转基因序列与基因组DNA(例如从种子集合获得的)内的非GMO参照序列的分数量对于管理和经济原因是重要的。存在一些用于灵敏检测样品中目标分析物的分数量的方法，然而，这些方法通常是昂贵且耗时的，或具有其他限制。例如，定量实时PCR(qPCR)测定仍然是用于确定靶核酸序列相对于测试样品内的非变体参照序列的相对量的标准方法。然而，qPCR的定量性能受每个样品和每个扩增子的扩增效率的变异性限制。影响扩增效率的因素包括来自样品基质以及提取试剂本身的抑制剂和伴随污染物。这些因素因样品和制备而异，但也在于它们影响一个序列与另一个序列相比的扩增效率的程度。目标相对于参照扩增子的扩增效率的轻微的可变差异限制了qPCR解析>1.5倍的量差异。此外，扩增反应需要专门的试剂组并且必须适当地储存，并且可能是耗时的并且对反应条件敏感。纳米孔装置的使用已经成为用于单分子鉴定的敏感工具，其中单个分子在施加电压下通过纳米孔移位时鉴定。纳米孔装置适合于现场应用，并且对于日常使用情况、人类健康、农业或其他任何地方而言足够便宜且有效。然而，来自纳米孔的数据的使用可能受到可能影响样品中分析物的定量估计的确定的误差，使得可靠地使用该数据是不可行的。因此，所需要的是确定目标分析物与样品中的参照分析物相比的分数丰度的改进方法，其是通用的、经济的且易于使用的。
技术实现思路
根据一些实施方案，本文提供了使用纳米孔装置确定混合的未知样品中目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法，包括在纳米孔装置中施加跨纳米孔的电压以单独地针对以下各项产生可检测的电子特征和诱导带电分析物通过所述纳米孔移位：对照样品，其包含已知与参照分析物的相对丰度的目标分析物，以及包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合未知样品，其中所述样品中所述目标分析物的相对丰度待确定；对于每个样品产生通过所述目标分析物或所述参照分析物通过所述纳米孔的移位产生的多个事件特征；从所述多个事件特征中鉴定与所述目标分析物相关的第一事件特征的量和与所述参照分析物相关的第二事件特征的量，以确定每个样品的第一和第二事件特征的检测相对丰度；和使用所述对照样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度来调整所述混合未知样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度，以校正检测相对丰度的误差，从而确定在所述混合未知样品中所述目标分析物的真实相对丰度的改进估计值。在一些实施方案中，样品是液体样品。在一些实施方案中，对照样品是包含所述目标分析物但不包含所述参照分析物的目标对照样品。在一些实施方案中，对照样品是参照对照样品，其包含所述参照分析物，但不包含所述目标分析物。在一些实施方案中，使用纳米孔装置确定混合未知样品中的目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法还包括向纳米孔装置施加电压以对于包含所述目标分析物但不包含所述参照分析物的目标对照样品诱导带电分析物通过纳米孔传感器的移位。在一些实施方案中，调整所述未知样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度包括使用所述目标对照样品和所述参照对照样品中的所述第一和第二事件特征的检测相对丰度以校正检测相对丰度的所述误差。在一些实施方案中，误差包括所述目标分析物的假阳性或假阴性检测误差。在一些实施方案中，使用纳米孔装置确定混合未知样品中目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法还包括向纳米孔装置施加电压以对于包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合对照样品诱导带电分析物通过纳米孔传感器的移位，其中所述目标分析物和所述参照分析物的相对丰度是已知的。在一些实施方案中，在所述未知样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度的调整包括使用所述目标对照样品、所述参照对照样品和所述混合对照样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度以校正检测相对丰度的所述误差。在一些实施方案中，误差包括假阳性目标分析物检测误差、假阴性目标分析物检测误差、所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异或其任何组合。在一些实施方案中，对照样品是包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合对照样品，其中所述目标分析物和所述参照分析物的相对丰度是已知的。在一些实施方案中，误差包括所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。在一些实施方案中，混合对照样品的所述目标分析物与所述参照分析物的相对丰度相对于所述混合的未知样品相差不超过1.2倍，1.5倍，2倍，5倍或10倍。在一些实施方案中，真实相对丰度的估计值是所述混合未知样品中所述目标分析物与所述参照分析物的真实比率的估计值。在一些实施例中，真实比率的估计值通过确定，其中参数ρ是可以补偿假阳性检测误差、假阴性检测误差或者两者的比率的估计值，并且其中参数α可用于补偿所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。在一些实施方案中，参数α是参照分析物捕获率除以目标分析物捕获率的比率的估计值。在一些实施方案中，真实相对丰度的估计值是所述混合未知样品中所述参照分析物和所述目标分析物的群体中的所述目标分析物的真实分数的估计值。在一些实施方案中，真实分数的估计值通过确定，其中参数ρ是可以补偿假阳性检测误差、假阴性检测误差或两者的比率的估计值，并且其中参数α可用于补偿所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。在一些实施方案中，参数α是参照分析物捕获率除以目标分析物捕获率的比率的估计值。在一些实施方案中，参数并且在一些实施方案中，如果使用所述对照样品，则参数Qtarg是在所述目标对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，或者如果没有使用目标对照样品，则Qtarg＝1。在一些实施方案中，如果使用所述参照对照样品，则参数Qref是在所述参照对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，或者如果不使用参照对照样品，则参数Qref＝0。在一些实施方案中，参数QX:Y是在所述混合对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，并且其中是混合对照样品中目标分析物(X)与参照分析物(Y)的已知比率(如果使用所述对照样品)，或者如果不使用混合对照样品，则α＝1。在一些实施方案中，参数Qmix是在所述混合未知样品中观察到的所述第一事件特征的分数。在一些实施方案中，通过核酸扩增制备未知或对照样品。在一些实施方案中，未知或对照样品不通过核酸扩增制备。在一些实施方案中，样品纯化以基本上由参照和目标分子组成。在一些实施方案中，样品未经纯化。在一些实施方案中，所述混合未知样品中所述参照分析物的量或浓度是已知的。在一些实施方案中，使用纳米孔装置确定混合未知样品中目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法还包括使用所述混合未知样品中所述目标分析物与所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用纳米孔装置确定混合未知样品中目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法，包括跨纳米孔装置中的纳米孔施加电压以产生可检测的电子特征并且单独地针对以下各项诱导带电分析物通过所述纳米孔的移位：对照样品，其包含已知与参照分析物的相对丰度的目标分析物，和包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合未知样品，其中所述样品中所述目标分析物的相对丰度待测定；对每个样品产生通过所述目标分析物或所述参照分析物通过所述纳米孔的移位产生的多个事件特征；从所述多个事件特征中鉴定与所述目标分析物相关的第一事件特征的量和与所述参照分析物相关的第二事件特征的量以确定每个样品的第一和第二事件特征的检测相对丰度；和使用所述对照样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度来调整所述混合未知样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度以校正检测相对丰度中的误差，从而确定所述混合未知样品中所述目标分析物的真实相对丰度的改进估计值。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.10.24 US 62/412,221;2017.03.31 US PCT/US2017/1.一种使用纳米孔装置确定混合未知样品中目标分析物的真实相对丰度的改进估计值的方法，包括跨纳米孔装置中的纳米孔施加电压以产生可检测的电子特征并且单独地针对以下各项诱导带电分析物通过所述纳米孔的移位：对照样品，其包含已知与参照分析物的相对丰度的目标分析物，和包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合未知样品，其中所述样品中所述目标分析物的相对丰度待测定；对每个样品产生通过所述目标分析物或所述参照分析物通过所述纳米孔的移位产生的多个事件特征；从所述多个事件特征中鉴定与所述目标分析物相关的第一事件特征的量和与所述参照分析物相关的第二事件特征的量以确定每个样品的第一和第二事件特征的检测相对丰度；和使用所述对照样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度来调整所述混合未知样品中所述第一和第二事件特征的检测相对丰度以校正检测相对丰度中的误差，从而确定所述混合未知样品中所述目标分析物的真实相对丰度的改进估计值。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照样品是目标对照样品，其包含所述目标分析物但不包含所述参照分析物。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照样品是参照对照样品，其包含所述参照分析物但不包含所述目标分析物。4.根据权利要求3所述的方法，其进一步包括向纳米孔装置施加电压以对于包含所述目标分析物但不包含所述参照分析物的目标对照样品诱导带电分析物通过纳米孔传感器的移位。5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述未知样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度的所述调整包括使用所述目标对照样品中和所述参照对照样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度校正所述检测相对丰度中的所述误差。6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述误差包括所述目标分析物的假阳性或假阴性检测误差。7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，还包括向纳米孔装置施加电压以对于包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合对照样品诱导带电分析物通过纳米孔传感器的移位，其中所述目标分析物和所述参照分析物的相对丰度是已知的。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述未知样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度的所述调整包括使用所述目标对照样品、所述参照对照样品和所述混合对照样品中所述第一和第二事件特征的所述检测相对丰度校正所述检测相对丰度中的所述误差。9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述误差包括假阳性目标分析物检测误差、假阴性目标分析物检测误差、所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异或其任何组合。10.根据权利要求1所述的方法，其中所述对照样品是包含所述目标分析物和所述参照分析物的混合对照样品，其中所述目标分析物和所述参照分析物的相对丰度是已知的。11.根据权利要求10所述的方法，其中所述误差包括所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。12.根据权利要求7-11中任一项所述的方法，其中所述混合对照样品包含所述目标分析物与所述参照分析物的相对丰度，其相对于所述混合的未知样品相差不超过1.2倍、1.5倍、2倍、5倍或10倍。13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述真实相对丰度的估计值是所述混合未知样品中所述目标分析物与所述参照分析物的真实比率的估计值。14.根据权利要求13所述的方法，其中所述真实比率的估计值由确定，其中所述参数ρ是可以补偿假阳性检测误差、假阴性检测误差或两者的比率的估计值，并且其中所述参数α可用于补偿所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。15.根据权利要求14所述的方法，其中α是所述参照分析物捕获率除以所述目标分析物捕获率的比率的估计值。16.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述真实相对丰度的估计值是所述混合未知样品中所述参照分析物和所述目标分析物的群体中所述目标分析物的真实分数的估计值。17.根据权利要求16所述的方法，其中所述真实分数的估计由确定，其中所述参数ρ是可以补偿假阴性检测误差、假阴性检测误差或两者的比率的估计值，并且其中所述参数α可用于补偿所述目标分析物和所述参照分析物之间的捕获率常数差异。18.根据权利要求17所述的方法，其中α是参照分析物捕获率除以目标分析物捕获率的比率的估计值。19.根据权利要求14或17所述的方法，其中和20.根据权利要求19所述的方法，其中如果使用所述对照样品，则Qtarg是在所述目标对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，或者如果没有使用目标对照样品，则Qtarg＝1。21.根据权利要求19或20所述的方法，其中如果使用所述参照对照样品，则Qref是在所述参照对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，或者如果不使用参照对照样品，则Qref＝0。22.根据权利要求19-21中任一项所述的方法，其中QX∶Y是在所述混合对照样品中观察到的所述第一事件特征的分数，并且其中如果使用所述对照样品，则是在混合对照样品中目标分析物(X)与参照分析物(Y)的已知比率，或者如果没有使用混合对照样品，则α＝1。23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中Qmix是在所述混合未知样品中观察到的所述第一事件特征的分数。24.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述未知或对照样品通过核酸扩增制备。25.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述未知或对照样品不是通过核酸扩增制备。26.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述样品被纯化以基本上由参照和目标分子组成。27.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述样品未纯化。28.根据上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合未知样品中所述参照分析...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵亚南，W·麦肯纳，W·B·邓巴，
申请(专利权)人：双孔人公司，
类型：发明
国别省市：美国,US