通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测制造技术

本文公开了用于通过进行目标与替代之间的竞争分析和随后在纳米孔隙中检测复合物类型来检测混合样品中的目标小分子的方法和组合物。本文公开了使用纳米孔隙检测小分子的竞争分析。足够大小(>20kDa)的目标分子在穿过固态纳米孔隙时引起电流阻抗、转位时间或其它可测量参数的变化。在目标分子不足够大且因此不引起明显的变化的情况中，另外的分子/试剂可以用于帮助检测。这一检测试剂将结合小分子或“捕获配体‑分子复合体”(例如，肽检测通过识别肽/适体复合体的单克隆抗体(mAb)帮助)。

Nano pore detection of small molecules by competitive analysis

A method and composition for detecting target small molecules in mixed samples by competitive analysis between targets and substitution and subsequent detection of complex types in nanopores are disclosed. In this paper, the competitive analysis of small molecules using nanoscale pores is disclosed. A target molecule of enough size (> 20kDa) changes the current impedance, transposition time, or other measurable parameters when it passes through solid nanoscale pores. In the case that the target molecules are not large enough and therefore do not cause significant changes, the other molecules / reagents can be used to help the detection. This kit will combine small molecules or capture ligand molecular complex \(for example, through the identification of peptide / peptide aptamer complex monoclonal antibody (mAb) help).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过竞争分析的小分子的纳米孔隙检测相关申请的交叉引用本申请要求2016年3月11日提交的U.S.临时专利申请No.62/131,969的权益，其公开内容通过引用全文合并于此。
技术介绍
小分子在许多生物功能中发挥重要作用。因为小分子可以例如通过与蛋白质结合和抑制或激活其正常功能来改变蛋白质的功能，它们可以扰乱/破坏该蛋白质在其中起作用的系统。转而，这类破坏可以触发疾病或加速疾病的进展。另一方面，通过控制小分子剂量，可以揭示关于蛋白质在这些系统中发挥的作用的详情(Stockwell,BrentR.“Exploringbiologywithsmallorganicmolecules.”Nature432.7019(2004):846-854)。检测小分子的存在和浓度也可以用于评估代谢过程如药物代谢的结果，其可能利于和加速临床试验和药物功效研究。在人和动物诊断之外，小分子也可以用于评估环境的状态，包括用于监测农业植物应激和水质。因此检测和准确定量小分子的能力在许多生物
中是有价值的。存在多种用于测量小分子的可用方法；一些是经济的，但缺乏精确度和灵敏度，而其它方法是非常灵敏的，但是是昂贵和复杂的。比较经济的高通量方法一般涉及将染料与感兴趣的目标分子结合并检测样品的总体荧光或吸光度。这种技术可以受到染料的非特异性或干扰分子的妨碍，这产生高假阳性和/或高假阴性。更复杂的分析方法，包括高效液相和质谱，能够精确地测量目标小分子，但其是复杂和昂贵的且需要专门的实验室空间和熟练的人员。因此，需要的是检测小分子的方法，其是经济的(与染料结合分析类似)，提供高特异性、灵敏度和精确度，且可以在便携设备上进行。用于检测和/或定量小分子的优选分析测试不局限于专门的实验室且不需要专门的设备或熟练的人员。另外，优选的分析装置是低成本和高重现性的。因此，需要用于在耐受广泛的纳米孔隙几何形状和/或较大纳米孔隙的低成本装置上提供精确和低成本分析结果的方法。
技术实现思路
本文公开了用于使用纳米孔隙检测小分子的竞争分析。足够大小(>20kDa)的目标分子在穿过固态纳米孔隙时引起电流阻抗、转位时间或其它可测量参数的变化。在目标分子不足够大且因此不引起显著的变化的情况中，另外的分子/腐蚀剂可用于帮助检测。这种检测试剂将结合小分子或“捕获配体-分子复合体”(例如，肽检测通过识别肽/适体复合体的单克隆抗体(mAb)帮助)。但是，仍然可能存在着这一策略不太理想的小分子(例如，药物化合物)。例如，由于用于结合另外的检测分子的可用表面积的减少，在目标小分子捕获时可能难以产生该目标小分子的检测试剂。因此，我们设计了使得能够检测小分子化合物且具有测量结合亲和力和动力学(Kon、Koff、Kd、Km等)的能力的新策略。该方法也适用于研究复杂的集合体(例如，HIVEnv蛋白质单体、二聚体或三聚体)。在一些实施方式中，本文提供了用于检测疑似存在于样品中的目标分子的存在或不存在的方法，该方法包括：提供包含层的装置，其中所述层将所述装置的内部空间分隔成第一体积和第二体积，其中所述层包含连接所述第一体积和所述第二体积的纳米孔隙，且其中所述装置包含配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体的传感器；提供替代分子、融合分子和聚合物骨架，所述融合分子包含适应于结合所述聚合物骨架以形成骨架/融合分子复合体的聚合物骨架结合结构域，和所述融合分子包含适应于结合所述替代分子或所述目标分子的目标分子结合结构域；通过将所述替代分子和所述融合分子与所述样品组合进行竞争分析，其中，如果所述目标分子存在于所述样品中，所述目标分子与所述替代分子竞争结合所述目标分子结合结构域；加载所述样品到所述第一体积中；施加跨所述纳米孔隙的电压，其中所述第一体积包含所述聚合物骨架、所述融合分子、所述替代分子和疑似包含所述目标分子的所述样品，其中所述聚合物骨架与所述融合分子杂交，且其中所述融合分子与所述替代分子或所述目标分子杂交。在一些实施方式中，施加的电压诱导与所述目标分子或所述替代分子结合的所述骨架/融合分子复合体从所述第一体积通过所述纳米孔隙转位以产生通过所述传感器检测的电信号的变化。在一些实施方式中，该方法还包括记录作为时间的函数的所检测的电信号变化。在进一步的实施方式中，该方法还包括分析所检测和记录的作为时间的函数的电信号变化以确定所述样品中所述目标小分子的存在或不存在。在一些实施方式中，竞争分析在加载所述样品到所述第一体积中之后进行。在一些实施方式中，竞争分析在加载所述样品到所述第一体积中之前进行。在一些实施方式中，替代分子包含马来酰亚胺聚乙二醇。在一些实施方式中，替代分子包含选自以下的化学反应性基团：酮、醛、异氰酸酯、胺、羧酸、卤化物、酯、马来酰亚胺、硫醇、二环碳酰亚胺(dicyclocarbimide)、吡啶基、吡啶二硫物和乙酰基。在一些实施方式中，替代分子包含强或弱的亲核体或亲电子体。在一些实施方式中，替代分子包含肽、树状分子、核酸、纳米或微米珠或颗粒、量子点、蛋白质、多核苷酸、脂质体、抗体或抗体片段。在一些实施方式中，替代分子包含适应于结合有效负荷分子的有效负荷结合位点。在进一步的实施方式中，有效负荷分子选自：树状分子、双链DNA、单链DNA、DNA适体、荧光团、蛋白质、抗体、多肽、纳米珠、纳米棒、纳米管、纳米颗粒、富勒烯、PEG分子、脂质体或胆固醇-DNA杂合体。在一些实施方式中，有效负荷分子包含电荷。在一些实施方式中，带电的有效负荷分子选自：肽、氨基酸、带电纳米颗粒、合成分子、核苷酸、多核苷酸、金属或离子。在一些实施方式中，替代分子通过选自以下的相互作用与所述有效负荷分子结合：共价键、氢键、离子键、范德华力、疏水相互作用、阳离子-pi相互作用、平面堆叠相互作用、金属键和生物素-抗生物素蛋白相互作用。在一些实施方式中，目标分子包含大小小于30,000Da、20,000Da、10,000Da、5,000Da、2,000Da、1,000Da、500Da、200Da、100Da、50Da、20Da或10Da的小分子。在一些实施方式中，目标分子包括肽、胰岛素、催产素、氨基酸、蛋白质或蛋白质的结构域、核苷酸、寡聚体、DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、激素、脂质、胆固醇类、代谢产物、糖类、聚糖类、肽聚糖、多聚聚糖(polyglycan)、磷脂、类固醇、化学合成的激动剂和拮抗剂、多核酸的合成衍生物、多环芳族烃、碳分解副产物、二噁英、环己酰胺、维生素、三磷酸腺苷和ATP类似物、神经递质、多巴胺、L-多巴、5-羟色胺、金属、电解质、有机金属、麻醉剂和麻醉剂衍生物、透明质酸或视黄醇。在一些实施方式中，融合分子包含肽核酸。在一些实施方式中，融合分子包含半胱氨酸标记的bis肽核酸。在一些实施方式中，融合分子包含桥连核酸、锁核酸、生物素、链霉亲和素、链霉亲和素衍生物、锌指蛋白、zfp结合结构域、CRISPR结构域、TALEN、DNA、PNA或RNA寡聚体。在一些实施方式中，聚合物骨架包括适应于在对所述纳米孔隙施加电位时通过所述纳米孔隙从所述第一体积到所述第二体积转位的带负电或带正电的聚合物。在一些实施方式中，聚合物骨架包括选自以下的分子：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、DNA/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测疑似存在于样品中的目标分子的存在或不存在的方法，包括：提供包含层的装置，其中所述层将所述装置的内部空间分隔成第一体积和第二体积，其中所述层包含连接所述第一体积和所述第二体积的纳米孔隙，且其中所述装置包含配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体的传感器；提供替代分子、融合分子和聚合物骨架，所述融合分子包含适应于结合所述聚合物骨架以形成骨架/融合分子复合体的聚合物骨架结合结构域，和所述融合分子包含适应于结合所述替代分子或所述目标分子的目标分子结合结构域；通过将所述替代分子和所述融合分子与所述样品组合来进行竞争分析，其中，如果所述目标分子存在于所述样品中，所述目标分子与所述替代分子竞争结合所述目标分子结合结构域；加载所述样品到所述第一体积中；施加跨所述纳米孔隙的电压，其中所述第一体积包含所述聚合物骨架、所述融合分子、所述替代分子和疑似包含所述目标分子的所述样品，其中所述聚合物骨架与所述融合分子杂交，且其中所述融合分子与所述替代分子或所述目标分子杂交。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.11 US 62/131,6931.一种用于检测疑似存在于样品中的目标分子的存在或不存在的方法，包括：提供包含层的装置，其中所述层将所述装置的内部空间分隔成第一体积和第二体积，其中所述层包含连接所述第一体积和所述第二体积的纳米孔隙，且其中所述装置包含配置为识别穿过所述纳米孔隙的物体的传感器；提供替代分子、融合分子和聚合物骨架，所述融合分子包含适应于结合所述聚合物骨架以形成骨架/融合分子复合体的聚合物骨架结合结构域，和所述融合分子包含适应于结合所述替代分子或所述目标分子的目标分子结合结构域；通过将所述替代分子和所述融合分子与所述样品组合来进行竞争分析，其中，如果所述目标分子存在于所述样品中，所述目标分子与所述替代分子竞争结合所述目标分子结合结构域；加载所述样品到所述第一体积中；施加跨所述纳米孔隙的电压，其中所述第一体积包含所述聚合物骨架、所述融合分子、所述替代分子和疑似包含所述目标分子的所述样品，其中所述聚合物骨架与所述融合分子杂交，且其中所述融合分子与所述替代分子或所述目标分子杂交。2.权利要求1的方法，其中所述电压诱导与所述目标分子或所述替代分子结合的所述骨架/融合分子复合体从所述第一体积通过所述纳米孔隙转位以产生通过所述传感器检测的电信号的变化。3.权利要求2的方法，还包括记录作为时间的函数的所述电信号的变化。4.权利要求3的方法，还包括分析作为时间的函数的所述电信号的变化以确定所述样品中所述目标小分子的存在或不存在。5.权利要求1-4任一项的方法，其中所述竞争分析在加载所述样品到所述第一体积中之后进行。6.权利要求1-4任一项的方法，其中所述竞争分析在加载所述样品到所述第一体积中之前进行。7.权利要求1-4任一项的方法，其中所述替代分子包含马来酰亚胺聚乙二醇。8.权利要求1-4任一项的方法，其中所述替代分子包含选自以下的化学反应性基团：酮、醛、异氰酸酯、胺、羧酸、卤化物、酯、马来酰亚胺、硫醇、二环碳酰亚胺、吡啶基、吡啶二硫物和乙酰基。9.权利要求1-4任一项的方法，其中所述替代分子包含强或弱的亲核体或亲电子体。10.权利要求1-4任一项的方法，其中所述替代分子包含肽、树状分子、核酸、纳米或微米珠或颗粒、量子点、蛋白质、多核苷酸、脂质体、抗体或抗体片段。11.权利要求1-4任一项的方法，其中所述替代分子包含适应于结合有效负荷分子的有效负荷结合位点。12.权利要求11的方法，其中所述有效负荷分子选自：树状分子、双链DNA、单链DNA、DNA适体、荧光团、蛋白质、抗体、多肽、纳米珠、纳米棒、纳米管、纳米颗粒、富勒烯、PEG分子、脂质体或胆固醇-DNA杂合体。13.权利要求11的方法，其中所述有效负荷分子包含电荷。14.权利要求13的方法，其中所述带电的有效负荷分子选自：肽、氨基酸、带电纳米颗粒、合成分子、核苷酸、多核苷酸、金属或离子。15.权利要求11的方法，其中所述替代分子通过选自以下的相互作用与所述有效负荷分子结合：共价键、氢键、离子键、范德华力、疏水相互作用、阳离子-pi相互作用、平面堆叠相互作用、金属键和生物素-抗生物素蛋白相互作用。16.权利要求1-4任一项的方法，其中所述目标分子包含大小小于30,000Da、20,000Da、10,000Da、5,000Da、2,000Da、1,000Da、500Da、200Da、100Da、50Da、20Da或10Da的小分子。17.权利要求1-4任一项的方法，其中所述目标分子包括肽、胰岛素、催产素、氨基酸、蛋白质或蛋白质的结构域、核苷酸、寡聚体、DNA、RNA、PNA、LNA、BNA、激素、脂质、胆固醇类、代谢产物、糖类、聚糖类、肽聚糖、多聚聚糖、磷脂、类固醇、化学合成的激动剂和拮抗剂、多核酸的合成衍生物、多环芳族烃、碳分解副产物、二噁英、环己酰胺、维生素、三磷酸腺苷和ATP类似物、神经递质、多巴胺、L-多巴、5-羟色胺、金属、电解质、有机金属、麻醉剂和麻醉剂衍生物、透明质酸或视黄醇。18.权利要求1-4任一项的方法，其中所述融合分子包含肽核酸。19.权利要求1-4任一项的方法，其中所述融合分子包含桥连核酸、锁核酸、生物素、链霉亲和素、链霉亲和素衍生物、锌指蛋白、zfp结合结构域、CRISPR结构域、TALEN、DNA、PNA或RNA寡聚体。20.权利要求19的方法，其中所述融合分子包含半胱氨酸标记的bis肽核酸。21.权利要求1-4任一项的方法，其中所述聚合物骨架包括适应于在对所述纳米孔隙施加电位时通过所述纳米孔隙从所述第一体积到所述第二体积转位的带负电或带正电的聚合物。22.权利要求1-4任一项的方法，其中所述聚合物骨架包括选自以下的分子：脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、肽核酸(PNA)、DNA/RNA杂合体和多肽。23.权利要求1-4任一项的方法，其中所述传感器配置为鉴别穿过仅单一纳米孔隙的物体。24.权利要求1-4任一项的方法，其中所述传感器是电传感器。25.权利要求24的方法，其中所述传感器检测在施加跨所述纳米孔隙的电压时通过所述纳米孔隙的电流。26.权利要求1-4任一项的方法，其中所述作为时间的函数的电信号的变化的分析包括分离与所述替代分子结合的所述骨架/融合复合体通过所述纳米孔隙转位导致的事件和与所述目标分子结合的所述骨架/融合复合体通过所述纳米孔隙转位导致的事件。27.权利要求1-4任一项的方法，其中所述方法提供大于90％、95％、98％或99％的所述目标小分子的检测置信度。28.权利要求1-4任一项的方法，其中所述样品在加载到所述第一体积中之前未纯化。29.权利要求1-4任一项的方法，其中所述纳米孔隙直径为至少5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm。30.权利要求1-4任一项的方法，其中所述装置包含至少两个串联的纳米孔隙，且其中与所述有效负荷分...

【专利技术属性】
技术研发人员：T·J·莫林，
申请(专利权)人：双孔人公司，
类型：发明
国别省市：美国,US