基于光学的纳米孔测序制造技术

在某些方面中，本发明专利技术涉及分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中纳米孔在空间上定向荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子大体上不响应于激发光束；当具有荧光标记物的核苷酸离开纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发时，检测由荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及由荧光信号的变化来识别离开纳米孔的核苷酸。

Optical-based nanopore sequencing

In some aspects, the present invention relates to a method for the analysis of polynucleotides. The method comprises the following steps: guiding an excitation beam with a predetermined polarization state to a nanopore; translocating a polynucleotide through a nanopore, in which the polynucleotide nucleotide is labeled with a fluorescent marker having an absorption dipole, and in which the nanopore is spatially oriented as a fluorescent marker. So that during translocation, the absorption dipole does not respond substantially to the excitation beam; when the nucleotide with a fluorescent marker leaves the nanopore and its absorption dipole becomes responsive to the excitation of the excitation beam with a predetermined polarization state, the change of the fluorescence signal generated by the fluorescent marker is detected; and the change of the fluorescence signal is used to identify the exit from the nanopore. Nucleotides of the nucleotide.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于光学的纳米孔测序相关申请的交叉引用本申请要求于2016年7月5日提交的美国临时专利申请第62/358,552号的优先权的益处，该临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。背景纳米孔测序(nanoporesequencing)已经被提出作为克服当前DNA测序技术中的一系列挑战的方法，包括降低每次运行的测序成本、简化样品制备、减少运行时间、增加序列读取长度、提供实时样品分析及类似方法。然而，用纳米孔的聚合物分析，例如DNA分析，具有其自身的一系列技术困难，例如可靠的纳米结构制造、DNA易位速率(translocationrate)的控制、明确的核苷酸识别、来自纳米标度传感器(nanoscalesensor)的大的阵列的信号的检测和处理等等，例如Branton等人，NatureBiotechnology,26(10):1146-1153(2008)。核苷酸的光学检测已经被提出作为纳米孔测序领域中一些技术困难的潜在解决方案，比如例如，从纳米孔的大阵列收集独立信号的困难。然而，实施光学方法存在许多挑战，特别是在光学噪音的显著背景下，测量易位多核苷酸时来自单个分子标记物的光学信号的困难。来自单个分子的荧光信号的测量已经被进行，并且已经通过将分子的荧光吸收偶极子(fluorescentabsorptiondipole)与激发光的电场矢量的方向对齐被优化，例如Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，第三版(Springer,2006)；Moerner等人，ReviewofScientificInstruments,74(8):3597-3619(2003)；Michalet等人，Ann.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,32:161-182(2003)，但所使用的技术未曾被应用于纳米孔测序。鉴于上文，如果方法可用于对齐或定向荧光标记物以用于优化的信号产生和检测，那么可以解决纳米孔测序中的光学信号的低信噪比(signal-to-noiseratio)的挑战。专利技术概述本专利技术涉及用于多核苷酸分析的方法和装置，所述多核苷酸分析使用纳米孔来对齐和/或定向荧光吸收偶极子(fluorescentabsorptiondipole)用于优先激发或静止。在一个方面中，本专利技术涉及分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将具有预先确定的偏振状态(polarizationstate)的激发光束引导至纳米孔；(b)将多核苷酸易位穿过纳米孔，其中多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中纳米孔在空间上定向荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子大体上不响应于激发光束；(c)当具有荧光标记物的核苷酸离开纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有预先确定的偏振状态的激发光束的激发时，检测由荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及(d)从荧光信号的变化识别离开纳米孔的核苷酸。本专利技术通过使用纳米孔在空间上限制和定向荧光标记物的吸收偶极子，有利地克服了基于光学的纳米孔测序(opticallybasednanoporesequencing)领域的以上问题。本专利技术的这些优点和其他优点在许多实施方式和应用中被例示，其中的某些在下文和整个说明书中被总结。附图简述图1A-1B图示出了本专利技术的示例性实施方案。图2图示出了采用相互猝灭荧光标记物和自猝灭荧光标记物的本专利技术的实施方案。图3A-图3B图示出了使用蛋白质纳米孔(proteinnanopore)和在纳米孔阵列上具有金属层的落射照明(epi-illumination)以减小背景或具有FRET激发的TIR的本专利技术的实施方案。图3C-图3D图示出了采用猝灭剂的实施方案。图4图示出了共聚焦落射照明系统的基本部件。图5图示出了用于激发纳米孔阵列中或附近的光学标记物而不产生FRET信号的TIRF系统的元件。图6是流程图，其图示出了用于基于包括来自多种光学标记物的光的光学信号的测量来调用(calling)核苷酸序列的步骤。图7A-图7C图示出了采用两种和三种荧光标记物的实施方案。专利技术详述虽然本专利技术适于多种修改和替代形式，但其细节已经在附图中通过实例的方式被示出并且将被详细地描述。然而，应当理解，本专利技术不将本专利技术限于所描述的特定实施方案。相反，意图覆盖落在本专利技术的精神和范围内的所有修改、等效物和替代物。例如，为了说明的目的，示出了本专利技术的特定的纳米孔类型和数目、特定的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而，应当理解，本公开内容不意图在这方面是限制性的，因为其他类型的纳米孔、纳米孔的阵列和其他制造技术可以被用于实施本文讨论的系统的多个方面。本专利技术的方面的指南在对本领域普通技术人员熟知的许多可用的参考文献和专著中找到，包括例如Cao,Nanostructures&Nanomaterials(ImperialCollegePress,2004)；Levinson,PrinciplesofLithography，第二版(SPIEPress,2005)；Doering和Nishi，编辑，HandbookofSemiconductorManufacturingTechnology，第二版(CRCPress,2007)；Sawyer等人，ElectrochemistryforChemists，第2版(WileyInterscience,1995)；Bard和Faulkner,ElectrochemicalMethods:FundamentalsandApplications，第2版(Wiley,2000)；Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，第3版(Springer,2006)；Hermanson,BioconjugateTechniques，第二版(AcademicPress,2008)及类似参考文献和专著，这些参考文献和专著的相关部分据此通过引用并入。在一个方面中，本专利技术涉及用于使用纳米孔和光学检测来分析多核苷酸例如DNA、RNA及类似物的方法和装置。在一个方面中，本专利技术采用选择的纳米孔不仅用于限制核苷酸以单个文件(file)的方式移动穿过检测区，而且还用于在易位期间定向荧光标记物，使得它们的吸收偶极子不响应于具有预先确定的偏振状态的激发光束，如图1A中示意性地图示的。每当核苷酸从纳米孔中出现时，它们的荧光标记物获得旋转和移动的自由度，使得它们可以被激发光束激发，以产生在发射的荧光中的跳跃，然后所述跳跃可以被用于识别出现的核苷酸。在某些实施方案中，激发光束的预先确定的偏振状态是其中光束的电矢量大体上正交于核苷酸标记物的特定组的吸收偶极子的状态。在某些实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括圆极化(circularpolarization)；在其他实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括线极化(linearpolarization.)。在另外的实施方案中，预先确定的偏振状态可以包括使用的激发光束的数目及其相对于纳米孔(例如，纳米孔的钻孔的轴线)的入射角。在某些实施方案中，可以采用多于一个激发光束，每个激发光束具有其自身的预先确定的偏振状态。在某些实施方案中，预先确定的偏本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；将多核苷酸易位穿过所述纳米孔，其中所述多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，所述吸收偶极子大体上不响应于所述激发光束；当具有荧光标记物的核苷酸离开所述纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有所述预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发时，检测由所述荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及由荧光信号的变化来识别离开所述纳米孔的核苷酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.05 US 62/358,5521.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：将具有预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；将多核苷酸易位穿过所述纳米孔，其中所述多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，所述吸收偶极子大体上不响应于所述激发光束；当具有荧光标记物的核苷酸离开所述纳米孔并且其吸收偶极子变为响应于通过具有所述预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发时，检测由所述荧光标记物产生的荧光信号的变化；以及由荧光信号的变化来识别离开所述纳米孔的核苷酸。2.如权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。3.如权利要求1所述的方法，其中所述荧光标记物被相互猝灭。4.如权利要求1所述的方法，其中所述易位的步骤包括在一种或更多种猝灭剂的存在下易位。5.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米孔包括蛋白质纳米孔。6.如权利要求1所述的方法，其中所述预先确定的偏振状态具有电场矢量，并且其中所述纳米孔中的所述荧光标记物的所述吸收偶极子大体上正交于所述预先确定的偏振状态的所述电场矢量。7.一种分析多核苷酸的方法，所述方法包括：将包括预先确定的偏振状态的激发光束引导至纳米孔；将多核苷酸易位穿过所述纳米孔，其中所述多核苷酸的核苷酸被标记有具有吸收偶极子的荧光标记物，并且其中所述纳米孔在空间上定向所述荧光标记物，使得在易位期间，吸收偶极子最大地响应于通过处于所述预先确定的偏振状态的所述激发光束的激发；检测由所述纳米孔中的核苷酸上的所述荧光标记物产生的光学信号；以及由所述光学信号来识别所述多核苷酸的核苷酸。8.如权利要求7所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。...

【专利技术属性】
技术研发人员：布雷特·N·安德森，
申请(专利权)人：昆塔波尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US