用纳米孔的聚合物分析中的混合光学信号制造技术

本发明专利技术涉及用于分析聚合物例如多核苷酸或蛋白质的基于纳米孔的方法，所述聚合物包含对于不同种类的单体特异性的光学标记物。在某些实施方案中，本发明专利技术的方法包括以下步骤：(a)将聚合物易位穿过纳米孔，其中聚合物的不同种类的单体被标记有产生可区分的光学信号的不同光学标记物，并且其中纳米孔限制单体将单个文件移动穿过包括多种单体的激发区；(b)当聚合物穿过激发区时，检测来自单体的光学信号的时间排序组；(c)将来自不同种类的单体的光学信号分开，以形成光学信号的单体特异性时间排序组；以及(d)由来自聚合物的光学信号的单体特异性时间排序组确定单体的序列。

Mixed Optical Signals in Polymer Analysis with Nanopore

The present invention relates to a nanopore-based method for the analysis of polymers, such as polynucleotides or proteins, comprising optical markers specific to different types of monomers. In some implementations, the method of the present invention includes the following steps: (a) translocation of polymers through nanoholes, in which different types of monomers of polymers are marked with different optical markers that produce differentiable optical signals, and in which nanoporous limiting monomers move a single document through an excitation region comprising a variety of monomers; (b) detection when the polymer passes through the excitation region; The time-ordering group of optical signals from monomers; (c) the optical signals from different types of monomers are separated to form the monomer-specific time-ordering group of optical signals; and (d) the monomer-specific time-ordering group of optical signals from polymers is used to determine the sequence of monomers.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用纳米孔的聚合物分析中的混合光学信号相关申请的交叉引用本申请要求于2016年4月14日提交的美国临时专利申请第62/322,343号的优先权的权益，该临时专利申请的内容通过引用以其整体并入本文。背景纳米孔测序(nanoporesequencing)已经被提出作为克服当前DNA测序技术中的许多挑战的方法，包括降低每次测序成本、简化样品制备、减少运行时间、增加序列读取长度、提供实时样品分析及类似方法。然而，用纳米孔的聚合物分析，例如DNA分析，具有其自身的一系列技术困难，例如可靠的纳米结构制造、DNA易位速率(translocationrate)的控制、明确的核苷酸识别、来自纳米标度传感器(nanoscalesensor)的大的阵列的信号的检测和处理等等，例如Branton等人，NatureBiotechnology,26(10):1146-1153(2008)。核苷酸的光学检测已经被提出作为纳米孔测序领域中一些技术困难的潜在解决方案，例如，从纳米孔的大阵列收集独立信号的困难。然而，在基于荧光的信号的情况下，克服单个分子的光学检测中的背景噪声仍然是显著的挑战，这已经导致显微镜系统的频繁使用，例如全内反射荧光(totalinternalreflectionfluorescence)(TIRF)系统，该系统通过限制激发的空间区来最小化背景激发。然而，即使在用于限制激发体积的当前可用的技术的情况下，在任何时刻收集的信号可以包括来自相同分辨率受限区(resolutionlimitedarea)和激发体积中的多个光学标记物的贡献，这使基本调用(basecalling)极大地复杂化。鉴于上文，如果尽管检测到包括来自多种空间上不可区分的标记物的光的光学信号，将允许明确的基本呼叫的方法和装置是可用的，那么对于纳米孔测序技术及其具体应用将是有利的，例如基于光学的纳米孔测序(optically-basednanoporesequencing)。专利技术概述本专利技术涉及用于使用光学标记物和纳米孔进行聚合物分析，特别是多核苷酸分析的方法和装置。在某些实施方案中，本专利技术涉及分析聚合物的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将聚合物易位穿过纳米孔，其中聚合物的不同种类的单体被标记有产生可区分的光学信号的不同光学标记物，并且其中纳米孔限制单体将单个文件(file)移动穿过包括多种单体的激发区；(b)当聚合物穿过激发区时，检测来自单体的光学信号的时间排序组(time-orderedset)；(c)将来自不同种类的单体的光学信号分开，以形成光学信号的单体特异性时间排序组；以及(d)由来自聚合物的光学信号的单体特异性时间排序组确定单体的序列。在其他实施方案中，本专利技术涉及分析多核苷酸的方法，所述方法包括以下步骤：(a)将多核苷酸易位穿过纳米孔，多核苷酸的核苷酸被标记有荧光标记物，并且纳米孔具有钻孔(bore)，所述钻孔在空间上限制荧光标记物以防止在其易位期间荧光信号的发射；(b)激发荧光标记物；(c)当多核苷酸易位穿过钻孔时，检测来自荧光标记物的荧光信号的时间序列；以及(d)从荧光信号的时间序列确定被附接至多核苷酸的核苷酸的荧光标记物的序列。本专利技术有利地克服了基于光学的纳米孔分析中的包括多于一种光学标记物的贡献的光学测量的问题。本专利技术的这些优点和其他优点在许多实施方式和应用中被例示，其中的某些在下文和整个说明书中被总结。附图简述图1图示出了使用FRET和落射照明系统(epi-illuminationsystem)的实施方案中的本专利技术的元件。图2A图示出了使用FRET和TIRF系统的实施方案中的本专利技术的元件。图2B图示出了实施方案中的本专利技术的元件，在所述实施方案中，当两种标记的单体穿过激发区时，它们同时发射光学信号。图3图示出了共聚焦落射照明系统的基本部件。图4A-图4B图示出了不具有FRET的用于激发的TIRF系统的元件。图5是流程图，其图示出了用于基于包括来自多种光学标记物的光的光学信号的测量来调用(calling)核苷酸序列的步骤。图6A-图6C图示出了分别在反式室(transchamber)、顺式室(cischamber)以及顺式室和反式室两者中采用猝灭剂(quenchingagent)的本专利技术的实施方案。图7图示出了使用蛋白质纳米孔(proteinnanopore)和在纳米孔阵列上具有金属层的落射照明以减小背景或具有FRET的TIR的本专利技术的实施方案。专利技术详述虽然本专利技术适于多种修改和替代形式，但其细节已经在附图中通过实例的方式被示出并将详细地被描述。然而，应当理解，本专利技术不将本专利技术限于所描述的具体实施方案。相反，本专利技术将覆盖落在本专利技术的精神和范围内的所有修改、替代物和等效物。例如，为了说明的目的，示出了本专利技术的特定的纳米孔类型和数目、特定的标记物、FRET对、检测方案、制造方法。然而，应当理解，本公开内容并不意图在这方面是限制性的，因为其他类型的纳米孔、纳米孔的阵列和其他制造技术可以被用于实施本文讨论的系统的多个方面。用于本专利技术的方面的指南可以在对于本领域普通技术人员熟知的许多可用的参考文献和专著中找到，包括例如Cao,Nanostructures&Nanomaterials(ImperialCollegePress,2004)；Levinson,PrinciplesofLithography,第二版(SPIEPress,2005)；Doering和Nishi，编辑，HandbookofSemiconductorManufacturingTechnology，第二版(CRCPress,2007)；Sawyer等人，ElectrochemistryforChemists，第2版(WileyInterscience,1995)；Bard和Faulkner,ElectrochemicalMethods:FundamentalsandApplications，第2版(Wiley,2000)；Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy，第3版(Springer,2006)；Hermanson,BioconjugateTechniques，第二版(AcademicPress,2008)；及类似参考文献和专著，所述参考文献和专著的相关部分据此通过引用并入。在一个方面中，本专利技术涉及用于使用纳米孔和光学检测分析聚合物的方法和装置。在某些实施方案中，不同种类的单体具有产生可区分的光学信号的不同标记物，所述可区分的光学信号允许识别单体。这样的标记的聚合物可以被易位穿过纳米孔，所述纳米孔限制单体将单个文件移动穿过分辨率受限区中的光学检测区或者交叉分辨率受限区中的光学检测区。从这样的分辨率受限区测量一系列光学信号，其中每个光学测量包括来自不同的邻近单体的多个分量信号(其在聚合物中的顺序不能由单个测量来确定，因为例如分量信号从衍射受限区内产生)。部分地，本专利技术基于以下认识和理解：在某些配置中，聚合物的基于光学的纳米孔分析(i)产生光学测量的时间序列，所述时间序列包括来自多于一种标记单体的序列的重叠贡献(overlappingcontribution)，从而使得难以(如果不是不可能的话)从单个测量确定单本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分析聚合物的方法，包括：将聚合物易位穿过纳米孔，其中所述聚合物的不同种类的单体被标记有产生可区分的光学信号的不同光学标记物，并且其中所述纳米孔限制所述单体将单个文件移动穿过包括多种单体的激发区；当所述单体穿过所述激发区时，检测来自所述单体的光学信号的时间排序组；将来自不同种类的单体的光学信号分开，以形成光学信号的单体特异性时间排序组；以及由来自所述聚合物的光学信号的所述单体特异性时间排序组确定单体的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.04.14 US 62/322,3431.一种分析聚合物的方法，包括：将聚合物易位穿过纳米孔，其中所述聚合物的不同种类的单体被标记有产生可区分的光学信号的不同光学标记物，并且其中所述纳米孔限制所述单体将单个文件移动穿过包括多种单体的激发区；当所述单体穿过所述激发区时，检测来自所述单体的光学信号的时间排序组；将来自不同种类的单体的光学信号分开，以形成光学信号的单体特异性时间排序组；以及由来自所述聚合物的光学信号的所述单体特异性时间排序组确定单体的序列。2.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是通过在标记的核苷三磷酸的存在下延伸退火至模板核酸分子的引物而标记的多核苷酸。3.如权利要求2所述的方法，其中所述引物包含具有标记的核苷酸的关键序列，当所述多核苷酸易位所述纳米孔并穿过所述激发区时，所述标记的核苷酸产生初始光学信号。4.如权利要求2所述的方法，其中所述标记的核苷三磷酸包含至少两种附接至至少两种不同种类的核苷三磷酸的可区分的荧光标记物，使得所述延伸的引物中的至少两种不同种类的核苷酸可以通过由所述可区分的荧光标记物产生的荧光信号来识别。5.如权利要求1所述的方法，其中所述聚合物是多核苷酸，并且其中所述确定的步骤包括从由所述光学信号确定的核苷酸的重叠片段形成候选序列。6.如权利要求1所述的方法，其中所述纳米孔是蛋白质纳米孔。7.如权利要求1所述的方法，其中所述检测的步骤还包括在所述激发区中激发所述光学标记物，以产生所述光学信号。8.如权利要求7所述的方法，其中所述光学标记物是荧光标记物，并且其中所述激发区具有由所述纳米孔、相邻荧光标记物的相互猝灭和/或猝灭剂确定的体积和几何形状。9.一种分析多核苷酸的方法，包括：将多核苷酸易位穿过纳米孔，所述多核苷酸的核苷酸被标记有荧光标记物，并且所述纳米孔具有钻孔，所述钻孔在空间上限制所述荧光标记物以防止在其易位期间荧光信号的发射；激发所述荧光标记物；当所述多核苷酸易位穿过所述钻孔时，检测来自所述荧光标记物的荧光信号的时间序列；以及从所述荧光信号的时间序列中确定被附接至所述多核苷酸的核苷酸的荧光标记物的序列。10.如权利要求9所述的方法，其中所述多核苷酸的不同种类的核苷酸上的所述荧光标记物发射有区别的荧光信号。11.如权利要求10所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：布雷特·N·安德森，马丁·胡伯，斯蒂芬·C·梅斯维兹，
申请(专利权)人：昆塔波尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US