HLA-B高分辨基因测序试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了HLA‑B高分辨基因测序试剂盒，包括1对扩增引物，如SEQ ID NO.1、2所示，以及用于测序的5条测序引物，如SEQ ID NO.3～7所示。本发明专利技术还公开了HLA‑B基因分型的检测方法：利用SEQ ID NO.1、2所示的扩增引物进行PCR扩增，然后利用SEQ ID NO.3～7所示的测序引物进行测序，从而确定HLA基因的型别。本发明专利技术的试剂盒和方法，对2、3、4外显子进行测序，必要时还可对1、5外显子进行补充测序，分型结果组合少。可对B位点全长进行准确分型，可兼并一代及二代测序平台，HLA基因测序试剂盒中主要试剂可自行配置并优化，大大降低的试剂成本同时，提高了分型的准确率。

HLA-B High Resolution Gene Sequencing Kit

The invention discloses a HLA B high resolution gene sequencing kit, which comprises a pair of amplified primers, as shown in SEQ ID NO.1 and 2, and five sequencing primers for sequencing, as shown in SEQ ID NO.3-7. The invention also discloses a detection method for HLA B genotyping: using the amplified primers shown in SEQ ID NO.1 and 2 for PCR amplification, and then using the sequencing primers shown in SEQ ID NO.3-7 for sequencing, so as to determine the type of HLA gene. The kit and method of the present invention can sequence exons 2, 3 and 4, and supplement exons 1 and 5 when necessary, with fewer typing results. The main reagents in HLA gene sequencing kit can be self-configurable and optimized, which greatly reduces the cost of reagents and improves the accuracy of typing.

【技术实现步骤摘要】
HLA-B高分辨基因测序试剂盒
本专利技术涉及一种HLA-B高分辨基因测序试剂盒，属于基因检测

技术介绍
人类主要组织相容性复合体(MHC)又称人类白细胞抗原(HLA)，是人类最复杂的遗传多态性系统。HLA基因位于人第6号染色体短臂6p21.31上，其编码的HLA-I类分子和HLA-II类分子在调控机体免疫应答、决定疾病易感性中发挥重要作用。根据基因位点的产物和它们的功能，HLA可以分为：Ⅰ类抗原：HLA-A、B、C位点的产物，Ⅱ类抗原：HLA-DR、DQ、DP位点的产物，三类抗原：C4A、C4B、C2、Bf等补体成分组成。多态性是HLA的重要特征，截止2018年5月，国际免疫遗传学数据库(IMGT,http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/)公布了18181种HLA等位基因，其中Ⅰ类和Ⅱ类抗原和移植密切相关。准确的HLA分型技术和分型数据已被广泛应用于器官和造血干细胞移植中寻找HLA相匹配的供者、HLA与疾病相关性的研究、亲子关系鉴定、个体识别以及以肽为基础的病毒和癌症疫苗的研发等应用领域。供受者间HLA等位基因的配合程度与移植效果密切相关，精确的HLA分型有助于提高移植后的存活率。目前国际标准的HLA分型技术有PCR-SSP(序列特异引物聚合酶链式反应)，PCR-SSO(聚合酶链式反应寡核苷酸探针杂交)和PCR-SBT(基于序列的分型方法)。SSO法的原理是设计HLA基因型别特异的寡核苷酸序列作为探针，对PCR产物进行标记，以PCR产物与探针进行杂交，通过检测信号判断基因型别。SSP法需要设计出一整套基因特异性引物，通过PCR技术获得特异性产物，通过电泳分析决定基因型别。PCR-SBT是对DNA进行直接测序分析基因分型方法，是WHO推荐的高分辨水平HLA基因分型的实验方法，可直接获得DNA序列，鉴定所有存在的多态性，为最直接、最直观的方法。直接测序分型(PCR-SBT)，是目前HLA高分辨率分型的“金标准”，SBT法分为一代测序和二代测序(NextGenerationsequencing，NGS)。PCR-SBT具有结果准确和自动化程度高等优点，能进行序列识别和分型，在发现新的等位基因方面更是具有独特的优势。一代测序方法自1977年诞生至今已经是一个很成熟的方法，二代测序相对于一代测序进行HLA分型具有高通量、易自动化、减少模棱两可结果等特点。目前一代测序HLA-B基因常规测序有2、3、4外显子。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术提供了一种HLA-B高分辨基因测序试剂盒，其可同时应用在一代测序和二代测序Illumina平台上，在控制成本，提高分型分辨率等方面都有优势。本专利技术是通过以下技术方案实现的：HLA-B高分辨基因测序试剂盒，包括用于扩增HLA-B基因全长的1对扩增引物(能够扩增HLA-B的1，2，3，4，5，6，7外显子，包含全外显子，扩增长度2.8K)，以及用于测序HLA-B基因2、3、4外显子的5条测序引物，其中，1对扩增引物的核苷酸序列如下所示：ampB-F：5'-TGTCGGGACCTTCTTCA-3'；如SEQIDNO.1所示；ampB-R：5'-AYAGACTCAGCACAGCGAAC-3'；(兼并碱基Y-TC)如SEQIDNO.2所示；所述5条测序引物的核苷酸序列如下所示：seqB2F：5'-GAGCGCACCGCTGGCG-3'；如SEQIDNO.3所示；seqB2R：5'-TGGGGTGTCGTGACCTG-3'；如SEQIDNO.4所示；seqB3F：5'-GGGGGCAGGGACACAC-3'；如SEQIDNO.5所示；seqB3R：5'-TTTCGTCCTCTTCTCGTTG-3'；如SEQIDNO.6所示；seqB4F：5'-CTCACGCTCTCACATGG-3'；如SEQIDNO.7所示。其中，测序2外显子的引物为seqB2F、seqB2R，测序3外显子的测序引物为seqB3F、seqB3R，测序4外显子的测序引物为seqB4F。进一步地，所述HLA-B高分辨基因测序试剂盒由扩增部分和测序部分组成，扩增部分包括以下组分：PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPMix，Taq酶和扩增引物ampB-F和ampB-R；Taq酶选用TAKARALATaq；测序部分包括以下组分：BigDyev3.1，BigDyev3.1Buffer，测序引物seqB2F、seqB2R，seqB3F、seqB3R，seqB4F。HLA-B基因分型的检测方法，包括以下步骤：(1)按照常规技术提取待测样本基因组DNA；(2)利用上述扩增引物(ampB-F和ampB-R)，对待测样本基因组DNA进行PCR扩增，得到含有HLA-B基因全长的扩增产物；(3)对扩增产物电泳：250V，10min，并使用核酸外切酶和虾碱性磷酸酶纯化；(4)纯化后的PCR产物，利用上述测序引物(seqB2F、seqB2R、seqB3F、seqB3R、seqB4F)分别测序2、3、4外显子，得到测序产物；(5)将测序产物变性、纯化、上机测序，得到测序结果；(6)将测序结果与数据库中的HLA基因的外显子标准序列进行对比，确定HLA基因的型别。进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增的反应条件为：96℃，2min；98℃，10s→65℃，50s→72℃，3min(30个循环)；72℃，5min；4℃保持。进一步地，所述步骤(4)中测序的反应条件为：96℃，10s；96℃，10s→50℃，10s→60℃，2min(25个循环)；12℃保持。本专利技术的基本原理是：HLA的多态性复杂，HLA-B等位基因约5212个，因此，要在有限的保守区域内设计出能扩增HLA-B位点全长的PCR引物，并针对2,3,4外显子再设计测序引物。HLA-B的引物设计模板为B*07:02:01:01基因型，等位基因序列均参照欧洲IMGT/HLA专业网站数据：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/index.html。本专利技术技术优势：本专利技术对2、3、4外显子进行测序，必要时还可对1、5外显子进行补充测序，分型结果组合少。同时本专利技术扩增体系已在二代测序平台进行稳定性验证，可对B位点全长进行准确分型，由于本专利技术可兼并一代及二代测序平台，HLA基因测序试剂盒中主要试剂可自行配置并优化，大大降低的试剂成本同时，提高了分型的准确率。本专利技术使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。附图说明图1：扩增样本电泳图。图2：B位点测序峰图。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步的说明。然而，本专利技术的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本专利技术的精神和范围的前提下，可以对本专利技术进行各种变化和修饰。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实施例1引物的设计和筛选使用PrimerPremier5设计了8对扩增引物(如表1所示)，21条测序引物(如表2所示)。使用设计出的8对扩增引物对已知型别样本进行扩增、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.HLA‑B高分辨基因测序试剂盒，其特征在于：包括用于扩增HLA‑B基因全长的1对扩增引物，以及用于测序HLA‑B基因2、3、4外显子的5条测序引物，其中，1对扩增引物的核苷酸序列如下所示：ampB‑F：5'‑TGTCGGGACCTTCTTCA‑3'；如SEQ ID NO.1所示；ampB‑R：5'‑AYAGACTCAGCACAGCGAAC‑3'；如SEQ ID NO.2所示；所述5条测序引物的核苷酸序列如下所示：seqB2F：5'‑GAGCGCACCGCTGGCG‑3'；如SEQ ID NO.3所示；seqB2R：5'‑TGGGGTGTCGTGACCTG‑3'；如SEQ ID NO.4所示；seqB3F：5'‑GGGGGCAGGGACACAC‑3'；如SEQ ID NO.5所示；seqB3R：5'‑TTTCGTCCTCTTCTCGTTG‑3'；如SEQ ID NO.6所示；seqB4F：5'‑CTCACGCTCTCACATGG‑3'；如SEQ ID NO.7所示。

【技术特征摘要】
1.HLA-B高分辨基因测序试剂盒，其特征在于：包括用于扩增HLA-B基因全长的1对扩增引物，以及用于测序HLA-B基因2、3、4外显子的5条测序引物，其中，1对扩增引物的核苷酸序列如下所示：ampB-F：5'-TGTCGGGACCTTCTTCA-3'；如SEQIDNO.1所示；ampB-R：5'-AYAGACTCAGCACAGCGAAC-3'；如SEQIDNO.2所示；所述5条测序引物的核苷酸序列如下所示：seqB2F：5'-GAGCGCACCGCTGGCG-3'；如SEQIDNO.3所示；seqB2R：5'-TGGGGTGTCGTGACCTG-3'；如SEQIDNO.4所示；seqB3F：5'-GGGGGCAGGGACACAC-3'；如SEQIDNO.5所示；seqB3R：5'-TTTCGTCCTCTTCTCGTTG-3'；如SEQIDNO.6所示；seqB4F：5'-CTCACGCTCTCACATGG-3'；如SEQIDNO.7所示。2.根据权利要求1所述的HLA-B高分辨基因测序试剂盒，其特征在于：所述HLA-B高分辨基因测序试剂盒由扩增部分和测序部分组成，扩增部分包括以下组分：PCRbuffer(含Mg2+)，dNTPMix，Taq酶和扩增引物ampB-F和ampB-R；Taq酶选用TAKARALATaq；测序部分包括以下组分：BigDy...

【专利技术属性】
技术研发人员：王林林，张倩，周云丽，刘克瑶，
申请(专利权)人：银丰基因科技有限公司，银丰生物工程集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37