一种大蒜白腐菌粗毒素鉴定方法技术

本发明专利技术属于植物病害预防技术领域，具体涉及一种大蒜白腐菌粗毒素鉴定方法。该方法包括菌株培养，提取大蒜白腐病菌粗毒素等步骤。本发明专利技术的创新点主要体现在用不同方法提取了大蒜白腐病菌粗毒素并进行了生物活性检测及结构鉴定。在大蒜白腐病菌粗毒素提取及鉴定方面均首先提出了一系列简单有效的方法。结果表明，用该方法提取的大蒜白腐病菌粗毒素可引起大蒜病斑产生，表明其具有生物活性。这为今后研究大蒜白腐病菌粗毒素提供了较为可靠简便的方法。同时，粗毒素组成成分的鉴定也为进一步研究其致病机理打下了坚实的基础，为今后植物抗病育种的研究提供了理论指导。

【技术实现步骤摘要】
一种大蒜白腐菌粗毒素鉴定方法
本专利技术属于植物病害预防
，具体涉及一种大蒜白腐病粗毒素鉴定方法。
技术介绍
大蒜(AlliumsativumL.)系百合科葱属植物，原产于欧洲南部与中亚，现在世界各地均有栽培。我国是大蒜的主要生产国和消费国，大蒜种植面积约占全球种植面积的75％，居世界首位。它既是日常生活中常用的调味品，也是重要的保健食品，还是出口创汇的主要蔬菜种类之一。近年来，随着大蒜的规模化种植和产业化发展，病虫害日益严重，已成为限制大蒜生产的重要因素。其中大蒜白腐病是大蒜毁灭性的病害，主要为害大蒜的根、鳞茎和叶，苗期还直接造成田间缺株死苗，该病在我国大蒜主产区危害严重。尤其是在低洼地块，发病株率在80％以上，严重减产甚至绝收。大蒜白腐病病原菌为半知菌亚门小核菌属白腐小核菌(SclerotiumcepivorumBerk.)，其生活史以菌丝和菌核两种形式为主。菌丝在PDA培养基上生长呈白色，绒毛状，较为稀疏。菌核黑色，球形至扁球形，大小0.4～1.1mm。菌丝生长的最适温度为12.0～21.0℃，在此温度下也易形成菌核，低于6.0℃或高于30.0℃时菌丝几乎停止生长；菌核在8.0～27.0℃范围内均可萌发，12.0～24.0℃为萌发的最适温度；菌丝和菌核的致死温度分别为45.0和50.0℃。菌丝在pH3.0～9.0环境下均可生长，最适pH为4.0～5.0；在pH4.0～5.0时菌核量最多，菌核萌发的适宜pH为4.0～9.0。光照条件对菌核萌发没有影响，但持续光照较易产生菌核。菌核萌发对空气湿度要求很高且范围很窄，空气湿度达到100％时菌核才能萌发。该病菌除可以侵染大蒜外，还可以为害大葱、韭菜、洋葱等作物。目前防治大蒜白腐病一般以农业措施为主，药剂防治为辅，适当结合物理、生物方法的综合防治措施。真菌毒素是由植物病原真菌产生的一类对寄主有毒的代谢产物，即真菌与寄主植物互作中的重要致病因子。Wood将植物病原真菌毒素分为寄主专化性毒素(Host-specifictoxins)和非寄主专化性毒素(Nonhost-specifictoxins)。迄今为止已报道9个属的21种植物病原真菌可以产生寄主专化性毒素，其中15种明确了其化学物质。寄主专化性毒素(HST)是指具有高度专化的寄主范围的致病微生物所产生的毒性物质，它们损害或破坏对产生毒素的微生物敏感的植物组织，但是对其它植物、微生物或动物则几乎没作用。可以认为有些植物病原菌之所以有高度专化的寄主范围，与它产生具有明显的专化性毒素有关。非寄主专化性毒素(NHST)是指来源于非寄主专化性的植物病原物的植物毒性化合物，它们对病原物的寄主和非寄主都是有毒的。一般认为非寄主专化性毒素对农业生产的破坏性大，没有明显的病菌小种或生理型与寄主品种间的专化性互作，因此毒素对寄主的作用往往起着一种致毒因子的作用。迄今为止，已发现非寄主专化性毒素近60种，如棉花黄萎病病菌毒素、玉米大斑病病菌毒素等。通常获取真菌毒素的方法是通过人工培养，大多数的病原菌培养是采用液体培养基，当菌丝生长达到最佳采毒时间时再根据毒素的特征采用不同的提取方法。由于己知的真菌毒素都为有机物质。因此，有机化学及生物化学中一些常用的方法都可用于毒素的提取、分离及纯化。概括起来，主要有浸提、吸附、萃取、结晶、重结晶、离心、超滤、分级沉淀及色谱技术，其中色谱技术是应用最多也是最有效的。目前对于大蒜白腐病菌粗毒素的研究，国内张林青等采用大蒜幼苗根系生长抑制率生物检测法，研究了大蒜白腐病病菌在不同培养基、培养时间、培养温度、培养液光照和振荡培养等条件下粗毒素的活性和产量。结果表明：大蒜白腐病病菌的最佳产毒培养基为Fries液体培养基，培养温度为18℃，培养基pH值为5.0，黑暗条件下连续振荡培养6天产生的粗毒素的毒性最强。而对其活性成分及鉴定则未做报道。本专利技术是首次对大蒜白腐病菌粗毒素进行了活性成分分析及鉴定，该方法可有效鉴定大蒜白腐病菌，为大蒜遗传育种方面的抗病性鉴定打下了坚实的基础。
技术实现思路
本专利技术提供了一种大蒜白腐病菌粗毒素鉴定方法。技术问题本专利技术的目的是针对目前对于大蒜白腐病菌粗毒素的研究处于空白的现状，提供一种大蒜白腐病菌粗毒素鉴定方法。技术方案本专利技术所提供的一种大蒜白腐病菌粗毒素鉴定方法是通过以下步骤完成：1)菌种的转接及培养把保存于PDA固体斜面培养基上的大蒜白腐病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为18℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的大蒜白腐病菌挑2块菌丝接种到20mL液体查彼克培养基(Czapek-Doxmedium)中，置于摇床上振荡培养约4-7d，温度为18℃，直至长出大量菌丝又不产生黑色菌核。2)粗毒素的提取把获得的大蒜白腐病菌培养液进行过滤，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积正丁醇。充分振荡摇匀后静置2h，将获得的有机相分别加入等体积的正丁醇再次进行萃取，重复3次，合并3次的有机萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除正丁醇，获得的浆状物加水定容至1mL即为粗毒素。乙酸乙酯萃取步骤同上。3)粗毒素的致病性鉴定取大蒜品种为G18大小一致的30个蒜瓣，置于光照2000lx，14h光照/12h黑暗、白天温度18℃，夜晚温度12℃培养箱中培养30d后，将幼苗取出，在叶片同一部位用牙签刺形成伤口，加5μL粗毒素，并用无菌棉进行保湿。以空白处理为对照，置于光照培养箱中，温度为18℃，设置光照黑暗各12h，每个处理重复3次，7d后观察病斑。4)粗毒素的组分鉴定将提取出的粗毒素溶于正己烷中，定溶至1mL。提取物用气质联用仪进行结构分析。气相色谱条件：色谱柱为TG-5MS(30mm×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱；载气为高纯氦气(纯度99.999％)；载气流速为1mL/min；采用不分流进样；进样口温度为280℃；程序升温：初始温度40℃保持1min，然后以6℃/min升到280℃，保持2min。质谱条件：离子源为EI源，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电子能量：70eV；扫描范围(m/z)：40-550amu，采用全扫描采集模式。附图说明图1为大蒜白腐病菌粗毒素在水稻叶片上的致病性鉴定。图2：为大蒜白腐病菌粗毒素气质联用图。具体实施方式1)菌种的转接及培养把保存于PDA固体斜面培养基上的大蒜白腐病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为18℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的大蒜白腐病菌挑2块菌丝接种到20mL液体查彼克培养基(Czapek-Doxmedium)中，置于摇床上振荡培养约4-7d，温度为18℃，直至长出大量菌丝又不产生黑色菌核。2)粗毒素的提取把获得的菌培养液进行过滤，得到的滤液分别在60℃下进行旋转蒸发直至滤液到达原体积的1/10，接着再加入等量体积正丁醇。充分振荡摇匀后静置2h，将获得的有机相分别加入等体积的正丁醇再次进行萃取，重复3次，合并3次的有机萃取相，在旋转蒸发仪上45℃进行旋转蒸发去除正丁醇，获得的浆状物加水定容至1mL即为粗毒素。乙酸乙酯萃取步骤同上。3)粗毒素的致病性鉴定将上述提取的粗毒素，滴加5μL在G18的大蒜叶片伤口，4-7d后观察。从图1可以看出，病菌粗毒本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种大蒜白腐菌粗毒素鉴定方法，其方法如下：1)菌种的转接及培养把保存于PDA固体斜面培养基上的大蒜白腐病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为18℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的大蒜白腐病菌挑2块菌丝接种到20mL液体查彼克培养基(Czapek‑Doxmedium)中，置于摇床上振荡培养约4‑7d，温度为18℃，直至长出大量菌丝又不产生黑色菌核。2)粗毒素的提取把获得的菌培养液进行过滤，滤液分别进行旋转蒸发，正丁醇抽提，离心去沉淀后获得粗毒素。3)粗毒素的致病性鉴定取大蒜品种为G18的叶片，在叶片上用牙签刺形成伤口，粗毒素处理后观察病斑。4)粗毒素的组分鉴定将提取出的粗毒素溶于正己烷中，定溶至1mL。提取物用气质联用仪进行结构分析。其质谱条件：离子源为EI源，传输线温度：280℃；离子源温度：300℃；电子能量：70eV；扫描范围(m/z)：40‑550amu，采用全扫描采集模式。

【技术特征摘要】
1.一种大蒜白腐菌粗毒素鉴定方法，其方法如下：1)菌种的转接及培养把保存于PDA固体斜面培养基上的大蒜白腐病菌转接到PDA固体培养基上，并置于设置温度为18℃恒温培养箱中培养72h。把转接好的大蒜白腐病菌挑2块菌丝接种到20mL液体查彼克培养基(Czapek-Doxmedium)中，置于摇床上振荡培养约4-7d，温度为18℃，直至长出大量菌丝又不产生黑色菌核。2)粗毒素的提取把获得的菌培养液进行过滤...

【专利技术属性】
技术研发人员：魏利辉，王晓宇，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏,32