一种河豚毒素标准生物样品的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。这种制备方法是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。本发明专利技术从TTX提取、纯化和制备纯品方面切入，以织纹螺为原料，并通过乙酸甲醇提取、大体积碳纳米管固相萃取净化粗提液，后将毒液浓缩，用制备高效液相进样进行纯化制备。本发明专利技术样品制备方法与过程操作简便、高效，适用于批量生产、工艺化制备河豚毒素标准生物样品。

【技术实现步骤摘要】
一种河豚毒素标准生物样品的制备方法
本专利技术涉及一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。
技术介绍
河鲀毒素(tetrodotoxin，TTX)是一种毒性极强的非蛋白类神经毒素，存在于河鲀(Tetraodontidae)和其它多种海洋生物体内。其作为镇痛药物和麻醉剂，在医药上用途广泛，水产动物源食品检测领域也需要TTX标准品。由于在净化和制备技术和工艺上存在难点，高纯度的TTX标准品供不应求。TTX制备主要依靠从生物材料中提取的方法获取，经过多步的纯化与浓缩步骤，从而获取高纯度的产品。传统的TTX标准样品制备流程多以河鲀鱼的内脏作为提取原料，用酸性溶剂提取，经过多种层析法除去杂质，结合多次重结晶和浓缩步骤获取高纯度的TTX产品。崔建洲等用醋酸水溶液提取河鲀肝脏中的TTX，采用D201和IR-86两种离子交换树脂对粗提取液进行净化处理，SephadexG-10葡聚糖凝胶除去蛋白质成分，用HPLC对粗品进行分离纯化，得到纯度为99.5％的TTX产品。国内也有易瑞灶和陈伟珠借助膜分离技术，用HPLC进行纯品分离制备，得到纯度为99％和97％的TTX产品。此外，还有利用海藻希瓦氏菌和梭形芽孢杆菌的细菌发酵法获取TTX产品。该方法可避免因获取原料而大量捕杀野生河鲀的问题，同时避免了对河鲀资源和生态平衡造成的破坏，且不受季节和地域的限制，但是利用细菌生产的TTX含量低，目前实际生产中难以大规模应用。TTX的化学结构比较复杂(见附图1)，人工合成存在较大难度，目前有关人工合成TTX技术的研究不多。日本学者Kishi等于1972年首次研究了人工合成外消旋TTX，此后又有立体选择性合成和不对称合成TTX的人工合成方法的报道出现。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有TTX标准品制备工艺上存在技术的缺陷和难点，高纯度的TTX标准品供不应求的情况，提供一种高纯度的河豚毒素生物标准样品的制备方法，该方法制备过程与操作简单、高效，适用河豚毒素织纹螺生物标准样品的批量制备和生产。本专利技术所采取的技术方案是：一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。这种河豚毒素标准生物样品的制备方法，包括以下步骤：1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节pH，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节pH，冷冻干燥至析出结晶，即河豚毒素标准生物样品。制备方法的步骤1)中，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶(5～6)。制备方法的步骤1)中，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为0.5％～1.5％。制备方法的步骤1)中，超声水浴提取的条件为：超声波功率150W～250W，超声波频率5kHz～7kHz，水浴温度50℃～70℃，提取时间10min～20min。制备方法的步骤2)中，装填碳纳米管的固相萃取柱使用前经活化处理，具体为：称取5g酸化处理的多壁碳纳米管，用甲醇作为分散剂，湿法装填于空的30mL小柱中，依次加入10mL乙酸-乙腈水溶液、10mL氨水活化和平衡小柱。制备方法的步骤2)中，乙酸-乙腈水溶液中乙酸的体积浓度为0.05％～0.15％，水和乙腈的体积比为8∶2；氨水的体积浓度为0.05％～0.15％。多壁碳纳米管的酸化处理具体为：取多壁碳纳米管粉末与硫酸、硝酸混合，超声振荡，静置后除去上层溶液，反复用水漂洗至中性，干燥后研磨，得到酸化处理的多壁碳纳米管。制备方法的步骤3)中，制备高效液相色谱进样的条件为：色谱柱：InertSustainAmide制备柱，规格为20mm×250mm，直径为5μm；进样量：5mL；流速：6.00mL/min；柱温：35℃，紫外检测波长200nm；流动相A为乙腈，流动相B为0.1％甲酸水溶液；梯度洗脱程序：0～10min，10％～80％流动相B；10.0min～12.5min，80％流动相B；12.5min～16.0min，80％～10％流动相B；16.0min～25.0min，10％流动相B。制备方法的步骤2)或步骤3)中，用氨水调节pH为8.5～9.0。本专利技术的有益效果是：本专利技术从TTX提取、纯化和制备纯品方面切入，以织纹螺为原料，并通过乙酸甲醇提取、大体积碳纳米管固相萃取净化粗提液，后将毒液浓缩，用制备高效液相进样进行纯化制备。本专利技术样品制备方法与过程操作简便、高效，适用于批量生产、工艺化制备河豚毒素标准生物样品。具体如下：(1)本专利技术方法采用毒性高、来源稳定的织纹螺代替河鲀卵巢、肝脏等作为提取原料，酸化甲醇超声波辅助萃取高效提取毒素，大体积的自填装碳纳米管固相萃取小柱有效净化粗提取的毒液，制备液相纯化液，真空冷冻干燥浓缩，制成用于检测分析和比对验证需要的河豚毒素标准生物样品。(2)本专利技术通过单因素试验优化提取工艺(溶剂、料液比、提取方式、温度因素)，自填装碳纳米管固相萃取大体积净化条件优化(碳纳米管酸化处理、柱子填料填装量、固相萃取净化流程)，制备液相纯化工艺研究(色谱梯度分离条件、优化毒素流出液收集参数)，建立了一种河豚毒素标准生物样品的制备方法。标准样品制备过程简单、高效，适合批量制备和工艺化生产。附图说明图1是TTX结构式图；图2是不同萃取溶剂的提取率比较图；图3是甲醇中乙酸比例对TTX提取效果的影响曲线图；图4是不同温度下样品中TTX提取率的曲线图；图5是上样液不同pH值对回收率的影响曲线图；图6是不同配比洗脱液的解吸效果比较图；图7是TTX标准溶液色谱图。具体实施方式一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，是用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。这种河豚毒素标准生物样品的制备方法，包括以下步骤：1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节pH，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱(HPLC)进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节pH，冷冻干燥至析出结晶，即本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。

【技术特征摘要】
1.一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：用乙酸甲醇溶液提取织纹螺样品，将粗提取液用碳纳米管固相萃取柱进行净化，净化的毒液进行高效液相色谱纯化，然后冷冻干燥浓缩，析出结晶，得到河豚毒素标准生物样品。2.根据权利要求1所述的一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)织纹螺样品的提取：取经充分匀质的织纹螺样品与乙酸甲醇溶液混合，超声水浴提取，再移取上清液，在残渣中加入乙酸甲醇溶液，重复提取1次，合并两次的粗提取液，备用；2)碳纳米管固相萃取柱净化：移取步骤1)的粗提取液，用氨水调节pH，通过装填碳纳米管的固相萃取柱净化，然后挤干柱中液体，用甲醇、纯水依次淋洗，挤干萃取柱，再用乙酸-乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液，备用；3)制备液相纯化：将步骤2)收集的洗脱液，水浴旋转蒸发浓缩至体积不变，除去乙腈溶剂；浓缩的毒液按照制备高效液相色谱进样的条件纯化，根据标准溶液河豚毒素的出峰时间，确定样品中目标毒素组分采集时间，收集该段时间内的流出液；流出液旋转蒸发浓缩，用氨水调节pH，冷冻干燥至析出结晶，即河豚毒素标准生物样品。3.根据权利要求2所述的一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：步骤1)中，织纹螺样品与乙酸甲醇溶液的料液比为1∶(5～6)。4.根据权利要求2或3所述的一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：步骤1)中，乙酸甲醇溶液中乙酸的体积浓度为0.5％～1.5％。5.根据权利要求2所述的一种河豚毒素标准生物样品的制备方法，其特征在于：步骤1)中，超声水浴提取的条件为：超声波功率150W～250W，超声波频率5kHz～7kHz，水浴温度50℃～70℃，提...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵东豪，王旭峰，王强，孙博伦，黎智广，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院南海水产研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44