一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液；S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。本发明专利技术还公开了上述口蹄疫疫苗的制备装置。本发明专利技术利用BHK‑21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，将BHK‑21贴壁细胞培养技术与分离纯化浓缩技术有机结合，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情，生产周期更短，成本更低，且质量更好。

【技术实现步骤摘要】
一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置
本专利技术属于生物制品
，具体涉及一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置。
技术介绍
口蹄疫(Footandmouthdisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Footandmouthdiseasevirus，FMDV)引起的引起的一种急性、发热性、高度接触性传染的动物传染病。口蹄疫主要侵害偶蹄类动物，其临床诊断特征为口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱，易感动物多达70多种。口蹄疫疫病传染性极强，可引起动物生产性能下降，一旦爆发会给被感染地区的畜牧业造成巨大的经济损失，严重影响国际贸易，被世界动物卫生组织列为必须在第一时间报告疫情的疫病之一。FMDV属于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒属(Aphthovirus)，血清型众多，包括0、A、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型共7个血清型。FMD疫苗经历了灭活疫苗、活疫苗、灭活疫苗这一历发展趋势，目前也有部分新型疫苗(合成肽疫苗)面市。其中，灭活疫苗最初使用舌皮组织毒经甲醛灭活制成的疫苗，经过将近20年的发展，现在主要通过细胞培养病毒经BEI灭活制成疫苗。对于口蹄疫疫苗的制备方法，目前本领域通常采用的是各种分离纯化加工单元的简单组合，例如，采用连续流离心搭配直流过滤、深层过滤、或者中空纤维过滤、PEG沉淀法或者色谱层析法等手段对收获的口蹄疫病毒细胞培养液进行分离和纯化，以获得纯化的口蹄疫病毒疫苗。这种分离纯化加工单元的简单组合难以发挥各加工单元的最佳分离纯化效率，造成产品品质、生产效率和生产成本极不平衡的状况，而这是人们所不希望的。随着家畜集约化养殖水平的提高，尤其是奶牛饲养量的增大，疫苗的轻微副反应，就可带来巨大的经济损失，如怀孕牛流产、泌乳牛产奶量下降、乳品质下降等，无任何副反应的疫苗在市场上有巨大的需求空间。现有的口蹄疫灭活疫苗主要存在以下两个问题：1.免疫保护力不稳定，主要表现在：免疫后检测不到中和抗体或者抗体水平很低，或者免疫期较短，只有2～3个月；2.免疫副反应大，主要是：下游生产工艺仍为传统方法，未经纯化处理，疫苗中存在一些培养基和宿主细胞中的杂质及过敏性物质，而且有效抗原含量低。这对口蹄疫的免疫防控工作带来极大的影响。近些年来，国内外关于疫苗分离纯化的研究群雄并起，异军突起，成绩斐然。在人用生物制品中，通过FDA认证的疫苗已有上百种，而正在研制开发中的疫苗达数千种之多，有关疫苗研究的科学论文和专利几乎都涉及到分离纯化技术，近年来这类文献呈现指数增长态势。但分离纯化技术仍未在兽用疫苗的生产中得到应用。随着我国畜牧业的发展，人们对兽用疫苗纯度和安全性等提出更高要求。疫苗的分离纯化主要是去除培养基和宿主细胞中的杂蛋白、肽、核酸及污染菌和它产生的内毒素，传统的蔗糖密度梯度离心法、沉淀和过滤技术在疫苗的抗原纯化中仍被普遍采用，但绝大部分是简单分离得到的粗制疫苗，其中抗原含量较低，且可能含有一些杂质和过敏性物质，这些传统疫苗的处理方法一般均存在纯度、活力以及安全性偏低，不适合应用于规模化生产等缺点，满足不了新疫苗的研制和生产的需要。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的上述问题，本专利技术目的在于提供一种口蹄疫疫苗的制备方法及其制备装置。本专利技术所采用的技术方案为：一种口蹄疫疫苗的制备方法，包括以下步骤：S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液，包括：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度为2x107个细胞/ml-9x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。本专利技术中，BHK-21细胞复苏并初级放大后，经2-4天的生物反应器微载体灌流培养，细胞液中细胞可达高密度2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml，全部细胞液被转移至大型细胞罐中进行接种，培养以获得毒液。此时，原生物反应器可经清洗、灭菌等步骤，重新开始新一轮疫苗生产。本方法在BHK-21细胞复苏并初级放大后，不需驯化细胞为纯悬浮细胞，也不需经过逐级放大过程，对比传统的悬浮培养工艺中的细胞培养过程，将大规模细胞培养过程的时间缩短了近70％，而细胞培养占整个疫苗培养的时间比为50％左右，因此疫苗的制备时间缩短了35％左右。将获得的毒液进行分离纯化，再灭活乳化，获得疫苗。本专利技术利用BHK-21贴壁细胞培养细胞液接种毒株再分离纯化，可以在短时间内进行多批次产品的生产，以应对突发的口蹄疫疫情。可选地，所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。其中，所述血清型为O型、A型、C型、SAT1型、SAT2型、SAT3型或Asia1型。每种主型又分若干亚型，目前发现的亚型已有70多种，本申请的口蹄疫疫苗的制备方法适用于各种口蹄疫病毒血清型毒株或其混合物。可选地，所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。可选地，所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培养液中的小分子杂质，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液。所述大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，其中，所述大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm。所述小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，其中，所述小分子杂质的尺寸小于5x105道尔顿。可选地，所述步骤S4具体包括以下过程：用1mM～3mM的BEI30℃灭活28小时，灭活液经2-10倍稀释后，按1:1重量比加矿物油佐剂乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。本专利技术还公开了上述口蹄疫疫苗的制备装置，包括依次连接的生物反应器、细胞罐、第一过滤组件和第二过滤组件；所述第一过滤组件包括依次连接的第一料液罐、第一主泵、第一过滤罐和第一恒流泵；所述第二过滤组件包括依次连接的浓缩罐、第二主泵、第二过滤罐和第二恒流泵；所述第一恒流泵与所述浓缩罐相连；所述第一过滤罐内设有去除所述大颗粒杂质的滤芯单元，所述第二过滤罐内设有去除所述小分子杂质的滤膜单元。工作时，在生物反应器中培养细胞液，当细胞密度达到2x107个细胞/ml至9x107个细胞/ml时，将全部细胞液转移至细胞罐中进行接种毒株，培养以获得毒液，获得的毒液进入第一料液罐中，由第一主泵抽至第一过滤罐中，经过第一次过滤去除大颗粒杂质后，再经过第一恒流泵送至浓缩罐中，浓缩罐中的毒液经过第二主泵送至第二过滤罐内，小分子杂质通过第二过滤罐内的滤膜单元随着滤过液排出。设置第一恒流泵和第二恒流泵以控制膜通量。其中，大颗粒杂质是指存在于口蹄疫病毒细胞培养液中的细胞碎片、细菌、聚集体、凝絮体等杂质，大颗粒杂质的最小直径大于0.05μm，大颗粒杂质的尺寸大于滤芯单元的孔径，因此不能通过滤芯单元而被截留在第一过滤罐中；小分子杂质是指口蹄疫病毒细胞培养液中的核酸及核酸碎片、宿主蛋白、病毒非结构蛋白、蛋白及病毒降解物、培养基成分等杂质，小分子杂质的尺寸小于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液；S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。

【技术特征摘要】
1.一种口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、获取口蹄疫病毒细胞培养液；S2、将所述口蹄疫病毒细胞培养液进行分离纯化，获得含有口蹄疫病毒的浓缩液；S3、收集所获得的含有口蹄疫病毒的浓缩液；S4、对收集的口蹄疫病毒的浓缩液进行灭活并乳化，获得口蹄疫灭活疫苗。2.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于，所述步骤S1包括以下过程：S11、BHK-21贴壁细胞经复苏和初级放大培养后，在生物反应器中使用微载体培养至细胞密度大于2x107个细胞/ml；S12、培养结束后的细胞液转移至大型细胞罐中稀释，接种口蹄疫病毒毒株，获取口蹄疫病毒细胞培养液。3.根据权利要求2所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述口蹄疫病毒毒株为口蹄疫病毒各血清型疫苗毒株其中至少一种。4.根据权利要求2所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述BHK-21贴壁细胞为未经过悬浮驯化筛选的贴壁细胞株。5.根据权利要求1所述的口蹄疫疫苗的制备方法，其特征在于：所述步骤S2具体包括以下过程：除去所述口蹄疫病毒细胞培养液中的大颗粒杂质并除去口蹄疫病毒细胞培...

【专利技术属性】
技术研发人员：付显东，孙素芳，姬彦波，张三喜，马力，陈奎，王劲松，李华，赵书强，罗志忠，
申请(专利权)人：付显东，
类型：发明
国别省市：河南,41