一种罗汉果苷的制备方法技术

罗汉果苷IIIE甜度高、口味较好，但在罗汉果中含量极低，无法大量提取制备。本发明专利技术公开发明专利技术了一种采用糖基水解酶定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷IIIE的方法，可用于罗汉果苷IIIE的大量绿色化制备，亦可为罗汉果苷IIIE的结构改造提供了物质基础。

【技术实现步骤摘要】
一种罗汉果苷的制备方法
本专利技术属于天然产物生物合成和食品化工
，具体涉及利用异源表达的糖苷水解酶水解罗汉果苷V制备天然非糖类甜味剂罗汉果苷ⅢE。
技术介绍
近些年来，由于高能量饮食的过多摄入，糖尿病、肥胖症等患者逐年增多，且由此产生的并发症对人类健康产生了严重危害。因此，寻找并开发低热量、健康的新型非营养型甜味剂逐渐成为行业的需求。由于口味纯正、甜度高、绿色健康等特点，罗汉果苷已逐渐成为新型天然非营养型甜味剂开发的一类热点化合物。自1983年Takemoto等从罗汉果S.grosvenorii果实中分离出甜味化合物罗汉果苷(Mogroside,MG)IV、V和VI后，已有超过30种同系列化合物被陆续分离鉴定，它们均为罗汉果苷元([10α-cucurbit-5-ene-3β,11α,24(R),25-tetraol])连接2至6个葡萄糖单元的四环三萜皂苷(LiC,etal.Chin.J.Nat.Med.,2014,12:89-102)。罗汉果苷初步甜味构效关系研究发现，含3个葡萄糖单元是罗汉果苷具有甜味的结构基础(WangL,etal.Molecules,2014,19:12676-12689.)，例如，罗汉果苷IIIE、IV、V和赛门苷I的甜度分别是5％蔗糖的300倍、350倍、425倍和560倍，但口味有所差异。因此，采用糖基化酶对具有3个葡萄糖基的罗汉果苷如罗汉果苷IIIE进行定点糖基化修饰，可获得一系列口味独特的非营养型甜味剂。罗汉果苷仅占罗汉果干燥果实的3.82％，结构中含3个糖的罗汉果苷IIIE含量甚微(LIC,etal.J.NaturalMedicines.,2014,12:89-102)，已成为了基于罗汉果苷IIIE的糖基化修饰开发不同口味的新型罗汉果苷类甜味剂的瓶颈。由于化学合成方法难度极大且成本高，市场接受度低，所以立体选择性和部位选择性强且绿色环保的生物催化剂成为罗汉果苷IIIE制备的首选策略。鉴于罗汉果苷V是罗汉果提取物中含量最高的甜味化合物，也是目前唯一可产业化提取制备的罗汉果苷类化合物。在结构分析后发现，罗汉果苷V只需选择性水解3位和24位以β-1,6-糖苷键连接的葡萄糖单元即可获得罗汉果苷IIIE。因此采用专一性强的糖苷水解酶建立绿色化罗汉果苷IIIE酶法合成工艺成为最佳选择。基于上述分析，本专利技术采用来源自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19对罗汉果苷V进行选择性水解，以绿色化制备罗汉果苷IIIE。与现有的天然提取方法相比，本专利技术提供了一种解决了罗汉果苷IIIE大量获得的方法，使基于IIIE糖基化修饰获得不同口味的罗汉果苷类甜味剂提供了物质基础。
技术实现思路
本专利技术的目的在于采用专一性强的糖苷水解酶EXG1及其突变体EXG19水解罗汉果苷V建立一种绿色、高效、经济的罗汉果苷ⅢE生物合成新方法。为基于罗汉果苷ⅢE的糖基化修饰开发新型优质非营养型甜味剂、药品和药用辅料奠定基础。为实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案具体如下：1)糖苷水解酶的基因来源糖苷水解酶EXG1来源自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，基因序列如SEQIDNO:1所示；糖苷水解酶EXG19为EXG1的突变体，基因序列如SEQIDNO:2所示。2)糖苷水解酶异源表达工程菌构建利用NdeI和XhoI将EXG1和EXG19的编码基因插入大肠杆菌表达载体pET-22b(+)，构建获得重组质粒pET-22b-exg1和pET-22b-exg19，然后分别转化至大肠杆菌BL21分别获得表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)。3)糖苷水解酶的诱导表达将E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)培养至OD600至0.9±0.1时，采用IPTG诱导表达糖苷水解酶。诱导表达条件为温度15℃、诱导剂IPTG0.4mM和诱导时间12小时。4)催化反应系统的构建粗酶液反应体系：由含EXG1或EXG19的大肠杆菌细胞提取液，罗汉果苷V以及缓冲液组成。原位反应体系：向E.coli(pET-22b-exg1)或E.coli(pET-22b-exg19)菌液种加入罗汉果苷V和葡萄糖。静息细胞反应体系：将离心收集的表达EXG1或EXG19的大肠杆菌细胞用缓冲液重悬后加入罗汉果苷V和葡萄糖。5)反应条件的优化由于粗酶液反应效率更高更可控，因此本专利技术优选粗酶液反应体系生物合成罗汉果苷IIIE，并优化其反应条件：pH为3.0-8.0，优选6.0；反应的温度为25-65℃，优选45℃；底物罗汉果苷V的浓度为1-10mg/mL，优选5mg/mL；反应时间为4-24小时，优选20小时。6)罗汉果苷IIIE的纯化反应完成后，加热离心去除蛋白或菌体，上清液浓缩后用C18层析柱分离纯化获得高纯度罗汉果苷ⅢE。本专利技术具有如下优点：1)与从罗汉果中提取制备罗汉果苷IIIE的方法相比，本专利技术采用糖苷水解酶催化罗汉果苷V水解制备罗汉果苷IIIE可实现IIIE的大量可获得性；2)与化学合成方法相比，本专利技术制备罗汉果苷IIIE的方法效率更高，更加绿色化，产品更易被市场接受；3)与糖基转移酶相比，采用糖苷水解酶制备罗汉果苷IIIE产物更加单一，且不需要成本高昂的糖基供体。综上所述，本专利技术建立了罗汉果苷IIIE生物合成方法，为罗汉果苷IIIE及其糖基化衍生物的制备和新型非营养型甜味剂开发提供了基础。附图说明图1为糖基水解酶催化罗汉果苷V水解的HPLC色谱图。图2为罗汉果苷IIIE的氢谱。图3为罗汉果苷IIIE的碳谱具体实施方式以下进一步提供实施实例，这些实施实例有助于理解本专利技术，仅用作说明而不限制本专利技术的应用范围。实施例1糖苷水解酶的表达菌株构建将来源自Saccharomycescerevisiae的糖苷水解酶EXG1的基因(SEQIDNO:1)委托苏州金唯智生物科技有限公司合成并利用NdeI和XhoI将其插入pET-22b的多克隆位点，获得重组质粒pET-22b-exg1。在此基础上，将质粒转化至大肠杆菌BL21，获得重组表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)。EXG19为EXG1的L63S，E414D的双点突变体(SEQIDNO:2)，该突变的重组表达菌株E.coli(pET-22b-exg19)的构建同EXG1。实施例2糖苷水解酶EXG1的诱导表达将工程菌株E.coli(pET-22b-exg1)接种至50mLLB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)，37℃、220rpm振摇过夜培养获得种子液，按5％接种量转接至LB培养基(含100μg/mL氨苄青霉素)中，37℃振摇培养至OD600＝0.8±0.1时，然后考察不同诱导温度、诱导剂浓度和诱导时间对。诱导表达完成后，离心收集菌体，并用0.1M磷酸钾缓冲液重悬，高压细胞破碎(25Kpsi)后离心收集上清，SDS-PAGE分析EXG1的可溶性表达情况，确定最佳的诱导条件。经检测，EXG1在15℃、20℃、25℃、30℃时的可溶性表达量分别为：16.5％、15.1％、14.3％和13.8％；IPTG浓度为0.2mM、0.4mM、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种罗汉果苷的制备方法，其特征在于使用糖苷水解酶EXG1和EXG19定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷ⅢE。

【技术特征摘要】
1.一种罗汉果苷的制备方法，其特征在于使用糖苷水解酶EXG1和EXG19定点水解罗汉果苷V生物合成罗汉果苷ⅢE。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的糖苷水解酶EXG1来源自酿酒酵母Saccharomycescerevisiae，序列如SEQIDNO:1所示；糖苷水解酶EXG19为EXG1的突变体，序列如SEQIDNO:2所示。3.根据权利要求1所述的糖苷水解酶，其特征在于将EXG1和EXG19的编码基因插入大肠杆菌表达载体pET-22b(+)的多克隆位点，构建重组质粒pET-22b-exg1和pET-22b-exg19，转化至大肠杆菌BL21分别获得表达菌株E.coli(pET-22b-exg1)和E.coli(pET-22b-exg19)。4.根据权利要求3所述的糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴旭日，卞柳云，花私齐，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32