一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法及在免疫层析中的应用技术

本发明专利技术公开了一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，可实现抗体在微球表面高效、取向、牢固地固定，使Fab端充分暴露且保持生物活性。该荧光微球探针的制备方法包括：活化羧基微球表面的羧基基团，化学偶联固定蛋白A或蛋白G，特异性结合抗体的Fc端，进而通过化学键将抗体不可逆地固定在蛋白A或蛋白G基底上，最后偶联荧光分子。本发明专利技术还提供了上述荧光微球探针在免疫层析中的应用，可显著提高检测的灵敏度和试纸条的稳定性。

【技术实现步骤摘要】
一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法及在免疫层析中的应用
本专利技术涉及一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法及在免疫层析中的应用，属于纳米材料及免疫分析领域。
技术介绍
免疫层析技术是一种新型快速的免疫分析技术，以便捷、快速、准确和无污染等特点被广泛应用于医学诊断、环境监测和食品安全等领域中标志物的识别和检测。荧光法由于灵敏度高、稳定性好、易于量化等优点，已逐步取代传统的胶体金法。其中，荧光探针的构建方式往往决定试纸条的技术水平。将抗体和荧光分子负载到微球载体上是当前的主流构建方式，与荧光分子直接标记抗体的方法相比，该方法能够有效提高探针靶向抗原能力并放大荧光信号。其中，抗体结合到微球上的数量、修饰到纳米载体上之后抗体的取向、抗体Fab端的免疫活性以及抗体与载体结合的牢固程度对免疫层析的灵敏度、特异性和重复性等指标具有关键影响。当前比较成熟的微球负载抗体的方法为物理吸附法和化学偶联法。此外，也有方法通过在抗体和微球之间引入夹层，间接将抗体修饰在微球上。物理吸附法中，抗体分子主要通过疏水作用和静电作用非特异性吸附到微球表面。该方法步骤简单，但容易受到抗体等电点、疏水基团分布、浓度、反应温度、孵育时间等各种因素影响，针对不同抗体需要摸索不同的反应条件。不同抗体分子吸附微球的能力不同，并且这种吸附是可逆的，不利于探针的质量控制。化学偶联法中，先活化表面携带活性基团(通常是羧基)的微球，再将抗体分子通过共价键偶联到微球表面。该方法能够保证一定的抗体偶联数量，将抗体牢牢固定在微球表面不易脱落。但共价键无选择地占用抗体上的活性基团，如果占用的基团在抗原结合区域或附近，则会削弱抗体活性。不论是物理吸附还是化学偶联，抗体分子的取向都是随机的，导致部分抗体的Fab端暴露不充分，结合抗原的能力减弱或完全失去。间接修饰的方法有很多种，基本思路都是将夹层材料固定在载体微球上，再将抗体固定在夹层材料上。夹层材料可以是亲和素或链霉亲和素，通过生物素-亲和素作用抓取并固定标记了生物素的抗体。该方法不能实现抗体的取向修饰，并且需要事先将抗体生物素化，降低了抗体的免疫活性。夹层也可以是蛋白A(SPA)或蛋白G(SPG)，特异性结合多种动物抗体大多数亚型的Fc端，结合速度快、效率高。夹层还可以是定制的具有IgG亲和性的多肽分子，也能特异性结合抗体的Fc端。蛋白质或多肽与Fc端的特异性结合使抗体取向修饰在载体微球上，Fab端充分暴露，且免疫活性不受影响。但这种结合是可逆的，且结合的强度与抗体的来源、亚型相关。蛋白A/G和抗体Fc端易结合又易解离的特质被广泛应用亲和层析法纯化抗体，但如果应用于制备探针和免疫层析，则需要抗体与载体更牢固地结合。否则多次洗涤、喷涂干燥、长期保存等极端条件，易导致抗体脱落，探针活性降低。
技术实现思路
为解决上述现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法及在免疫层析中的应用。该制备方法通过将蛋白A(或蛋白G)、抗体逐层修饰在载体微球上，并用交联剂将抗体牢固地固定在蛋白A或蛋白G基底上，可实现抗体的高效结合和取向修饰，使Fab端充分暴露，免疫活性不受影响，且避免抗体脱落。最后修饰荧光分子即得到探针。该探针能够提高侧向免疫层析检测的灵敏度和重复性，以及试纸条保存的稳定性。为实现上述目的，本专利技术提供了一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，包括以下步骤：1)用交联剂活化羧基微球表面的羧基基团，再将能够与IgGFc端特异性结合的蛋白质偶联到微球上，得到Fc端特异的微球；2)将Fc端特异的微球与抗体孵育，使抗体取向修饰在微球表面，进而通过交联剂将抗体通过化学偶联的方式固定在微球上，得到抗体取向修饰的微球；3)将抗体取向修饰的微球与带有活性基团的荧光分子偶联，得到抗体取向修饰的荧光微球探针。用于制备上述探针的微球为聚苯乙烯微球，微球的粒径为50～500nm。在步骤1)中，所述的交联剂可为单独的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)联用。所述能够与IgGFc端特异性结合的蛋白质可为天然蛋白G、天然蛋白A、重组蛋白G或重组蛋白A。在步骤2)中，所述孵育的条件可为pH4～7，温度4～37℃，时间1h～12h；所述交联剂为EDC；所述偶联条件可为pH4～7，温度25～37℃，时间1～4h。在步骤3)中，所述活性基团可为异硫氰酸根、NHS酯、Sulfo-NHS酯等能够与蛋白质上的氨基化学偶联的基团；所述荧光分子可选自cy5-NHS酯、cy7-NHS酯、罗丹明、荧光素、AlexaFluor610、AlexaFluor633和AlexaFluor647中的一种；所述偶联条件可为pH6～9，温度25～37℃，时间1h～12h。抗体取向修饰的荧光微球探针在免疫层析中的应用，包括以下步骤：1)将取向修饰的荧光微球探针均匀地喷涂在处理过的聚酯或玻璃纤维垫上，常温干燥24h，得到结合垫；2)将硝酸纤维素膜粘贴在PVC底板上，将包被抗体和质控抗体划在硝酸纤维素膜上，得到检测线和质控线；3)将样品垫、结合垫、吸水纸按层析方向依次搭接并粘贴在底板上，用斩切机切成宽2～6mm的试纸条，然后将试纸条放置于卡壳内；4)在卡壳加样孔内滴加样品，经免疫层析后，插入荧光免疫分析仪中检测层析结果。其中，在卡壳加样孔内滴加的样品可为血清、血浆、全血、尿液等体液或经稀释的上述样品。本专利技术所述的抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，可实现抗体在微球表面高效、取向、牢固地固定。作为夹层的蛋白A或蛋白G，高效识别并靶向抗体的Fc端，使具有免疫活性的Fab端向外暴露，改善探针结合抗原的效率。随后利用EDC作为交联剂将夹层和抗体通过共价键结合，使抗体不可逆地偶联在载体微球上。此外，这种先取向固定后化学偶联的方式，共价键主要在夹层蛋白和Fc端之间形成，可有效避免传统化学偶联法导致的Fab端位点被占用、免疫活性下降的副作用。上述荧光微球探针应用于免疫层析中，可显著提高检测的灵敏度和试纸条的稳定性。附图说明图1：不同方法制备的荧光微球探针结构示意图，静电吸附法(a)、化学偶联法(b)、蛋白A/G直接结合抗体法(c)和蛋白A/G取向结合抗体+化学偶联固定的本方法(d)；图2：不同方法制备探针时，每1mg微球上抗体的结合效率与脱落程度，静电吸附法(1)、化学偶联法(2)、蛋白G直接结合抗体法(3)和蛋白G取向结合抗体+化学偶联固定的本方法(4)；图3：免疫荧光层析试纸条结构图，试纸条由PVC底板1和在底板1上依次搭接的样品垫2、结合垫3、硝酸纤维素膜4和吸水纸5和划在硝酸纤维素膜4上的检测线6和质控线7组成；图4：不同方法制备的探针应用于侧向免疫层析试纸条，检测梯度浓度cTnI样本的结果。化学偶联法(1)、蛋白G直接结合抗体法(2)和蛋白G取向结合抗体+化学偶联固定的本方法(3)，R2都可达到0.99，(3)的读值随浓度增长更快；图5：不同方法制备的探针应用于侧向免疫层析试纸条，检测cTnI浓度为0.1ng/mL样本和0n本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)用交联剂活化羧基微球表面的羧基基团，再将能够与IgG Fc端特异性结合的蛋白质偶联到微球上，得到Fc端特异的微球；2)将Fc端特异的微球与抗体孵育，使抗体取向修饰在微球表面，进而通过交联剂将抗体通过化学偶联的方式固定在微球上，得到抗体取向修饰的微球；3)将抗体取向修饰的微球与带有活性基团的荧光分子偶联，得到抗体取向修饰的荧光微球探针。

【技术特征摘要】
1.一种抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)用交联剂活化羧基微球表面的羧基基团，再将能够与IgGFc端特异性结合的蛋白质偶联到微球上，得到Fc端特异的微球；2)将Fc端特异的微球与抗体孵育，使抗体取向修饰在微球表面，进而通过交联剂将抗体通过化学偶联的方式固定在微球上，得到抗体取向修饰的微球；3)将抗体取向修饰的微球与带有活性基团的荧光分子偶联，得到抗体取向修饰的荧光微球探针。2.如权利要求1所述的抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，其特征在于：所述的微球的种类为聚苯乙烯微球，微球的粒径为50～500nm。3.如权利要求1所述的抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，其特征在于：在步骤1)中，所述交联剂可为单独的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)联用或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)与N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sulfo-NHS)联用；所述能够与IgGFc端特异性结合的蛋白质可为天然蛋白G、天然蛋白A、重组蛋白G或重组蛋白A。4.如权利要求1所述的抗体取向修饰的荧光微球探针的制备方法，其特征在于：在步骤2)中，所述孵育的条件可为pH4～7，温...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宇，娄豆豆，韩国志，
申请(专利权)人：南京东纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32