一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法技术

本发明专利技术涉及生物组织的微观观察技术领域内一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法，将获取的待观察组织材料进行表面清洗后依次进行化学固定、脱水处理、免疫荧光染色和透明化处理；再将组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察，再通过Imaris软件处理各层细胞分布图像数据，重建细胞组织的三维模型，观察三维立体模型中被免疫荧光标记细胞的立体分布，再利用Imaris Bitplane Spot检测分析，计算出免疫荧光标记细胞的准确数目。本发明专利技术的方法保持了待观察组织的完整性，而且观察细胞分布的清晰度和准确度都高，细胞的数目统计结果更准确。

【技术实现步骤摘要】
一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法
本专利技术涉及生物组织的微观观察
，特别涉及一种观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法。
技术介绍
在生命科学研究和临床病理学分析中，观察生物组织中细胞的微观分布和统计细胞数目，对研究细胞分化、组织发育、疾病发生等具有非常重要的意义。研究这一过程的常规方法是对组织进行连续切片后，利用免疫组织化学染色，然后通过不同切片间的图像数据拼接和叠加来模拟和推测出完整组织中细胞的分布，进而推算特定细胞的数目。但是，这一常规方法的局限性是，连续切片并不能完全显示真正的组织全貌、细胞分布和特定细胞数量。组织切片只能显示某一个层面的细胞分布和数量，况且在实际制作切片时，很难避免对组织的破坏和丢失，无法保证单个切片细胞分布和数量的准确性，同时，也很难保证不同切片厚度的均一性，这就导致叠加后的结果更加不准确，即便是用数学模型来重建和计算，其最终的结果也只是预测和估算而已，并非真实的图像和数据，这就造成同样的生物组织样品，最后结果的可变系数非常大，特别是细胞数量的结果可信度不高。如何在保持组织完整性的同时，观察特定细胞在组织内部的分布和数量，是生物学研究和医学研究的一个重点和热点。虽然，现在临床医学常用的计算机断层扫描（CT），正电子发射计算机断层扫描（PETCT）,核磁共振成像（MRI）等技术得到了快速发展，但到目前为止，其分辨率仍达不到细胞水平或亚细胞水平。
技术实现思路
本专利技术的目的是，提供一种保持组织完整性的同时观察微小组织内细胞立体分布及统计细胞数目的方法，为生命科学研究和临床病理学分析提供一种在细胞水平或亚细胞水平观察组织和统计细胞数量的方法。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术首先提供一种观察微小组织内细胞立体分布的方法，包括以下步骤：获取待观察的组织材料并进行表面清洗；对所获取的组织材料进行化学固定和脱水处理；对脱水处理后的组织材料进行免疫荧光染色；对免疫荧光染色的组织材料进行透明化处理；将透明化处理的组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。本专利技术的方法，通过对整体生物组织进行化学固定、脱水处理、免疫荧光染色和透明化处理，保持获取的整体生物组织的完整性，对组织内的特异性细胞进行识别和荧光标记以便于观察，然后通过激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。本专利技术的方法中对生物组织的整体处理和观察过程，保持组织整体的完整性，不需要分层切片观察，实现细胞水平或亚细胞水平的高分辨率精确观察。作为本专利技术的优选，所述组织材料的厚度小于500μm，所述逐层扫描拍照的层厚间距为1～5μm。本专利技术的组织材料的化学固定步骤包括：组织材料的化学固定步骤包括：在2～5℃的条件下将冲洗后的组织材料浸泡在质量浓度为3.5～4.5%多聚甲醛水溶液中固定2～2.5小时；之后，移除多聚甲醛水溶液，在2～5℃的条件下，将组织材料分别用磷酸缓冲液进行振荡洗脱3～4小时，所述磷酸缓冲液每隔1小时更换一次。通过本步的处理，降低组织中蛋白质、肽类物质等多种物质的水溶性以便于将组织材料进行硬化固定，保证整体组织的完整性。为便于实现组织材料内细胞的彻底脱水，本专利技术的脱水处理步骤包括：移除脱水处理后的组织材料中磷酸缓冲液，在2～5℃的条件下，将组织材料用质量浓度为9～11%和19～21%的蔗糖水溶液振荡洗脱3～4小时；之后，继续在2～5℃的条件下将组织材料用质量浓度为29～31%的蔗糖水溶液振荡洗脱12-15小时。进一步地，本专利技术的免疫荧光染色步骤包括：移除脱水处理后的蔗糖溶液，将组织材料依次进行透膜处理和封闭处理、然后分别用一抗和荧光标记的二抗依次孵育48～72小时，最后通过荧光染料进行荧光染色。进一步地，本专利技术的透膜处理过程为：在20～25℃的条件下，将组织材料在透膜液中振荡孵育12～15小时，所述透膜液为质量浓度为0.4～0.6%的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。本步的透膜处理过程，通过透膜时间的控制可以提高组织材料的细胞膜通透性，并使得完整组织内部细胞达到同样的细胞膜通透性；以便后续处理过程中抗体（包括一抗和二抗）能够顺利进入完整组织内部细胞。进一步地，本专利技术方法中的封闭处理过程为：移除透膜处理的组织材料中的透膜液，在4～5℃的条件下，将透膜处理的组织材料在封闭液中振荡孵育12～15小时，所述封闭液成分包括以下质量组份水溶液：0.4～0.6%的聚乙二醇辛基苯基醚、0.10～0.20%的甘氨酸、9～11%的胎牛血清、3～4%的牛血清白蛋白。通过本步处理，可以降低后续处理过程中抗体的非特异性结合，消除假阳性信号的发生。为便于识别某一类特异性细胞，本专利技术的一抗和二抗孵育过程包括:S1)移除封闭处理的封闭液，在4～5℃条件下，将封闭处理的组织材料移入一抗溶液中，以50～60rpm的转速摇床孵育48～72小时；通过一抗孵育使一抗与生物组织中某一类细胞特异表达的蛋白相结合，来达到识别组织内某一类细胞的目的；S2）移除一抗溶液，在2～5℃条件下，用质量浓度为0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液进行清洗，以50～60rpm的转速摇床洗涤3～4小时，且每隔1小时更换一次水溶液；通过本步处理可以清洗掉未发生特异性结合的一抗；S3）移除上步的清洗水溶液，将组织材料移入二抗溶液中，在2～5℃避光条件下，以50～60rpm的转速摇床孵育48～72小时，如果S1)中的一抗耦合有荧光基团，本步省略；本步的目的是用荧光标记的二抗对S1）中的一抗进行免疫识别，以便于后续步骤中通过荧光显微镜能分辨出特异性细胞；S4）移除二抗溶液，在42～5℃条件下，将组织材料移入质量浓度0.1%的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液进行清洗，以50～60rpm的转速摇床洗涤3～4小时，且每隔1小时更换一次水溶液，如果S3）省略，则本步省略；S5）移除上步的清洗液，在2～5℃避光条件下，将组织材料移入DAPI稀释液中，以50～60rpm的转速摇床孵育10～12小时，以识别标记组织内所有细胞，所述DAPI稀释液为4',6-二脒基-2-苯基吲哚稀释水溶液；通过本步过程，可以使DAPI分子与组织内所有细胞的DNA结合，以便于观察组织内所有的细胞分布及前步抗体识别标记的特异性细胞在组织内的分布。进一步地，所述透明化处理步骤包括：将免疫荧光染色的组织材料移入透明液中，在20～25℃避光条件下，以50～60rpm的转速摇床孵育48～72小时，所述透明液为以下质量组份的水溶液：22～26%的尿素、8～12%的甘油、0.9～0.12%的聚乙二醇辛基苯基醚、48～52%的蔗糖。通过本步的处理，可以使得激光穿透组织表层，进入组织内部，进而使得显微镜能够识别完整组织内部的荧光信号。本专利技术的方法，将待观察的生物组织通过上述处理，在保持待观察的生物组织的完整性的同时，通过特异性抗体对组织内的某一类细胞进行荧光标记，在透明化处理之后，利用激光共聚焦显微镜识别完整组织全部的荧光信号，真实而立体地显示特异性标记的细胞在完整组织中的空间分布。本专利技术解决了完整组织内部细胞的荧光标记和显微观察，将完整组织的观察提高的细胞水平和立体层面；理论上，借助于高分本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取待观察的组织材料并进行表面清洗；对所获取的组织材料进行化学固定和脱水处理；对脱水处理后的组织材料进行免疫荧光染色；对免疫荧光染色的组织材料进行透明化处理；将透明化处理的组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。

【技术特征摘要】
1.一种观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，包括以下步骤：获取待观察的组织材料并进行表面清洗；对所获取的组织材料进行化学固定和脱水处理；对脱水处理后的组织材料进行免疫荧光染色；对免疫荧光染色的组织材料进行透明化处理；将透明化处理的组织材料连同透明液移至共聚焦显微镜专用培养皿，用激光共聚焦显微镜进行逐层扫描拍照，获得整体组织各层的细胞分布图像，进行细胞立体分布的观察。2.根据权利要求1所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，所述组织材料的厚度小于500μm，所述逐层扫描拍照的层厚间距为1～5μm。3.根据权利要求1所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，组织材料的化学固定步骤包括：在2～5℃的条件下将冲洗后的组织材料浸泡在质量浓度为3.5～4.5%多聚甲醛水溶液中固定2～2.5小时；之后，移除多聚甲醛水溶液，在2～5℃的条件下，将组织材料分别用磷酸缓冲液进行振荡洗脱3～4小时，所述磷酸缓冲液每隔1小时更换一次。4.根据权利要求1所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，所述脱水处理步骤包括：移除脱水处理后的组织材料中磷酸缓冲液，在2～5℃的条件下，将组织材料用质量浓度为9～11%和19～21%的蔗糖水溶液振荡洗脱3～4小时；之后，继续在2～5℃的条件下将组织材料用质量浓度为29～31%的蔗糖水溶液振荡洗脱12-15小时。5.根据权利要求1所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，免疫荧光染色步骤包括：移除脱水处理后的蔗糖溶液，将组织材料依次进行透膜处理和封闭处理、然后分别用一抗和荧光标记的二抗依次孵育48～72小时，最后通过荧光染料进行荧光染色。6.根据权利要求5所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，所述透膜处理过程为：在20～25℃的条件下，将组织材料在透膜液中振荡孵育12～15小时，所述透膜液为质量浓度为0.4～0.6%的聚乙二醇辛基苯基醚水溶液。7.根据权利要求5所述的观察微小组织内细胞立体分布的方法，其特征在于，所述封闭处理过程为：移除透膜处理的组织材料中的透膜液，在4～5℃的条件下，将透膜处理的组织材料在封闭液中振荡孵育1...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱家桥，刘宗平，卞建春，刘学忠，袁燕，顾建红，张江虹，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32