本发明专利技术公开了一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用。该试纸条包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，二甲戊灵半抗原是由3‑(1‑乙基丙氨)‑6‑甲基‑2,4‑二硝基苯甲醛与3‑肼基丙酸反应得到。本发明专利技术还提供了该试纸条的制备方法和应用该试纸条检测二甲戊灵残留的方法。本发明专利技术的试纸条具有灵敏度高、检测快速、操作方便、经济实用等优点。
【技术实现步骤摘要】
一种检测二甲戊灵的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用
本专利技术属于农药残留检测领域，具体涉及一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条及其制备方法和应用，其特别适用于农产品、烟草及烟草制品中二甲戊灵残留的检测。
技术介绍
二甲戊灵是一种旱田作物选择性除草剂，可以广泛应用于玉米、大豆、花生、棉花、直播旱稻、马铃薯、烟草、蔬菜等多种作物田除草。目前，二甲戊灵是世界第三大除草剂，销售额仅次于灭生性除草剂草甘膦、百草枯，也是世界上销售额最大的选择性除草剂，在我国农业生产中的应用非常广泛。因此，二甲戊灵在农作物中的残留问题也受到了高度关注。GB2763-2016《食品安全国家标准食品中农药最大残留限量》中规定二甲戊灵在稻谷、韭菜、结球甘蓝、普通白菜、菠菜、芹菜、大白菜中的最大残留限量（MRL）为0.2mg/kg，在糙米、玉米、棉籽、大蒜、莴苣中的MRL为0.1mg/kg；美国规定二甲戊灵在豆类、茶叶、大蒜中的MRL为0.1mg/kg，在韭菜中的MRL为0.2mg/kg，在胡萝卜中的MRL为0.5mg/kg；欧盟规定二甲戊灵在豆类、胡萝卜中的MRL为0.2mg/kg，在芹菜中的MRL为0.1mg/kg。国际烟草科学研究合作中心（CORESTA）规定烟草中二甲戊灵的指导性残留限量为5mg/kg，我国尚未制定烟草中二甲戊灵的最大残留限量。目前二甲戊灵的检测方法主要是仪器检测方法，如气相色谱法、气相色谱-质谱法、气相色谱串联质谱法，等。但是由于这些分析方法需要昂贵的大型仪器设备和专业的检测人员、前处理过程复杂、操作繁琐、检测成本高、分析速度慢，难以满足现场监测和大量样本中农药残留量快速筛查的需要。因此，开发一种不受检测设备限制并且能够实现对大批量样品进行快速检测的产品和方法成为迫切需要解决的问题。荧光微球免疫层析技术是在荧光染料标记技术上发展起来的，作为一种免疫学检测方法，它是免疫亲和技术、免疫标记技术、免疫层析技术的结合，具有快速、操作简便等优点。相比传统标记物，荧光微球的发光强度可以随激发光的强度增强而增强，所以荧光微球标记有望提高免疫层析技术的检测限；而在微球壳结构的作用下，荧光微球具有相对稳定的形态结构，粒度均一、单分散性好、稳定性好、发光效率高、重复性好，有较好的生物相容性；且形成微球后染料荧光猝灭大大减少，发射强而稳定，且基本不受外界环境介质变化的影响。因此，荧光微球免疫层析技术同时具有检测灵敏度高、操作简便、稳定性好的优点。截至目前，市场上尚未有二甲戊灵荧光微球免疫层析试纸条出现。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种灵敏度高、操作简单、成本低、检测时间短的二甲戊灵残留检测荧光微球免疫层析试纸条；本专利技术的另一个目的是提供上述试纸条的制备方法；本专利技术的再一个目的是提供上述试纸条在检测二甲戊灵中的应用。为了实现上述目的，本专利技术采取的一个技术方案是：提供一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，它包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二甲戊灵半抗原是由3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛与3-肼基丙酸反应得到，其分子结构式为：。所述二甲戊灵半抗原的制备方法如下：取0.60g3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛，加50mL乙腈溶解，澄清后，滴加溶解0.32g3-肼基丙酸的甲醇溶液5mL，室温搅拌3h；停止反应，旋蒸除去有机溶剂，加水，加氢氧化钠0.45g，溶解澄清后，加80mL乙酸乙酯萃取，分去有机相，水相加稀盐酸调节pH=4，加50mL氯仿萃取，水洗，浓缩，用体积比1:1的乙醇/石油醚重结晶，得到半抗原产物0.70g。所述二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、甲状腺蛋白、人血清白蛋白。所述二甲戊灵单克隆抗体是由二甲戊灵单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述羊抗鼠抗抗体是将鼠源抗体免疫羊得到。所述荧光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种制备上述检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条的方法，它包括如下步骤：1）样品结合垫的制备：用市售的荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后制备；2）硝酸纤维素膜的制备：将二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物喷涂到硝酸纤维素膜上的检测区范围，制成检测区；将羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜上的质控区范围，制成质控区；3）组装和剪切：在底板上依次搭接粘贴包埋有荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。具体地说，步骤包括：1）半抗原制备：将3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛与3-肼基丙酸经过一系列反应得到二甲戊灵半抗原产物；2）将二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联，得到二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物；3）用二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到二甲戊灵单克隆杂交瘤细胞株；4）提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠抗抗体；5）分别将二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物和羊抗鼠抗抗体喷涂到硝酸纤维素膜的检测区范围（T）和质控区范围（C）；6）将样品结合垫用含牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲体系中的终浓度为0.5%体积百分含量）、pH值为7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液均匀浸泡2h，37℃下烘干2h；7）用市售的荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体，并将其以特定缓冲体系稀释后，将6）处理过的样品结合垫浸泡于稀释缓冲液中，经真空冷冻干燥后备用；8）在底板上依次搭接粘贴包埋有荧光微球标记二甲戊灵单克隆抗体的样品结合垫、固定有检测区和质控区的硝酸纤维素膜及吸水垫，并剪切成所需的宽度即为荧光微球免疫层析试纸条。本专利技术采取的另一个技术方案是提供一种上述检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条在检测二甲戊灵中的应用，它包括如下步骤：1）样品前处理；2）用所述的检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条进行检测；3）用荧光检测仪分析检测结果。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：（1）特异性强、灵敏度高：本试纸条采用将荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体包埋在样品结合垫上，具有亲水性佳、可大容量吸附抗体偶联物、迅速重湿润、抗体结合物释放充分、性能好、释放快、形态好等优势，从而减少误差，降低成本，增加整个体系的反应灵敏度；（2）荧光微球表面包裹了聚苯乙烯，实现了对荧光物质异硫氰酸荧光素的保护，减少了外界环境的干扰，增加了荧光微球的稳定性及荧光寿命；（3）荧光微球表面修饰活性基团—COOH，采用化学偶联的方法来标记抗体，形成本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述二甲戊灵半抗原‑载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二甲戊灵半抗原是由3‑(1‑乙基丙氨)‑6‑甲基‑2,4‑二硝基苯甲醛与3‑肼基丙酸反应得到，其分子结构式为：
【技术特征摘要】
1.一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于：包括底板及在底板上依次搭接粘贴的样品结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述样品结合垫上包埋有荧光微球标记的二甲戊灵单克隆抗体，所述硝酸纤维素膜上固定有检测区和质控区，检测区喷涂有二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物，质控区喷涂有羊抗鼠抗抗体，所述二甲戊灵单克隆抗体是以二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述二甲戊灵半抗原-载体蛋白偶联物是由二甲戊灵半抗原与载体蛋白偶联得到，所述二甲戊灵半抗原是由3-(1-乙基丙氨)-6-甲基-2,4-二硝基苯甲醛与3-肼基丙酸反应得到，其分子结构式为：。2.如权利要求1所述的检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述二甲戊灵半抗原的制备反应过程如下：。3.如权利要求1所述的一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述荧光微球是直径为100~300nm的用聚苯乙烯包裹荧光物质的微球，其表面连接有—COOH基团，所述荧光物质为异硫氰酸荧光素。4.如权利要求1所述的一种检测二甲戊灵残留的荧光微球免疫层析试纸条，其特征在于：所述载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈黎，范子彦，刘惠民，唐纲岭，崔华鹏，樊美娟，蔡君兰，王晓瑜，赵乐，贾云祯，
申请(专利权)人：中国烟草总公司郑州烟草研究院，国家烟草质量监督检验中心，
类型：发明
国别省市：河南,41
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