一种供药学应用的蛋白酶变体制造技术

本发明专利技术公开了一种供药学应用的蛋白酶变体，涉及生物工程技术技术领域，其包含序列表中的SEQ ID NO.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点。该供药学应用的蛋白酶变体，以及以糖基化识别序列Asn‑Xaa‑Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点，直接采用双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点进行标记酶切，从而在根本上提高了蛋白酶变体在氨基酸层面的酶切处理效率，副产物更少，使之在药学上经过适配性连接之后的应用更加广泛，并且使得所得蛋白酶变体的适应性更高。

A Protease Variant for Pharmaceutical Application

The present invention discloses a protease variant for pharmaceutical application, which relates to the technical field of biotechnology. It contains the SEQ ID NO.1 amino acid sequence in the sequence table. The amino acid sequence removes the first 20 amino acids in the 25 amino acid proenzyme-activated peptide segments of the N-terminal of the original gene, and the residual sequence of the N-terminal proenzyme-activated peptide is the intestinal kinase recognition site. The protease variant for pharmaceutical application, as well as the glycosylation recognition sequence Asn_Xaa_Ser/Thr as template, 82 Asn near the active site amino acid Asp89 was selected as the pseudoglycosylation site, and the digestion efficiency of the protease variant at the amino acid level was fundamentally improved by direct double digestion and insertion of the corresponding monoclonal site of pPIC9K. Fewer by-products make it more widely used in pharmacy after adapting ligation, and make the obtained protease variants more adaptable.

【技术实现步骤摘要】
一种供药学应用的蛋白酶变体
本专利技术涉及生物工程
，具体为一种供药学应用的蛋白酶变体。
技术介绍
蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。前者可把大分子量的多肽链从中间切断，形成分子量较小的朊和胨；后者又可分为羧肽酶和氨肽酶，它们分别从多肽的游离羧基末端或游离氨基末端逐一将肽链水解生成氨基酸。蛋白水解酶催化多肽或蛋白质水解的酶的统称，简称蛋白酶。广泛分部于动物、植物以及细菌当中，种类繁多，在动物的消化道以及体内各种细胞的溶酶体内含量尤为丰富。蛋白酶对机体的新陈代谢以及生物调控起重要作用。分子量一般在2-3万左右。蛋白酶按水解底物的部位可分为内肽酶以及外肽酶，前者水解蛋白质中间部分的肽键，后者则自蛋白质的氨基或羧基末端逐步降解氨基酸残基。随着生物基因工程在基础研究领域和应用领域的不断进步，采用一定手段对蛋白酶进行处理，可以使之应用到社会中很多方面，酶法水解蛋白质广泛用于制备生物活性肽，但酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点，偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种供药学应用的蛋白酶变体，解决了目前酶解法存在目标肽得率低、副产物过多的缺点，偶然因素也会影响蛋白水解酶的酶切效果的问题。(二)技术方案为达到以上目的，本专利技术采取的技术方案是：一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的SEQIDNO.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点。所述蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合依然存在，所述蛋白酶的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7-9个残基。优选的，所述蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点。优选的，所述序列为SEQIDNO.1的氨基酸来自迟缓芽孢杆菌的蛋白酶的位置36、42、47、56、61、69、87.96、101、102、104、114、118、120、130、139、141、142、154、157、188、193、205、211、224、229、236、237、242、243、255和268相关联的一或多个位置引入单个或多个氨基酸取代，其中所述蛋白酶包含根据SEQIDNO.1计数的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合。优选的，所述氨基酸酶原激活肽是一种具有多种生物活性的多肽，包括PACAP-38和PACA-27两种，分别由38和27个氨基酸组成，后者的氨基酸顺序与PACAp-38的N端1～27个氨基酸残基完全相同。优选的，所述蛋白酶作为起始分子降解的蛋白质会先被连接上泛素作为标记，即蛋白质上的一个赖氨酸与泛素之间形成共价连接，泛素被转移到E1的活性中心的半胱氨酸残基上，并伴随着第二个泛素分子的腺苷酸化。优选的，所述β亚基具有共同的降解机制催化活性，而各个β亚基对于底物的特异性却略有不同，并且每一个具有催化活性的β亚基也都含有一个降解所必需的保守的赖氨酸。(三)有益效果本专利技术的有益效果在于：1、该供药学应用的蛋白酶变体，通过采用N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点，以及以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点，直接采用双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点进行标记酶切，从而在根本上提高了蛋白酶变体在氨基酸层面的酶切处理效率，副产物更少，使之在药学上经过适配性连接之后的应用更加广泛，并且使得所得蛋白酶变体的适应性更高。2、该供药学应用的蛋白酶变体，蛋白酶的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，当结合到微管中时，微管蛋白积累了许多翻译后修饰，其中许多是这些蛋白质所特有的，这些修改包括detyrosination，乙酰化，polyglutamylation，polyglycylation，磷酸化，泛素化，SUMO化，和棕榈酰化，对一些微管中的乙酰化科学研究具备了极大地借鉴意义，特别是α-微管蛋白N-乙酰转移酶(ATAT1)，它被证明在许多生物和分子功能中发挥重要作用，它与人类神经系统疾病密切相关，可以针对性的应用到神经系统药物制备上。具体实施方式下面对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。本专利技术提供一种技术方案：一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的SEQIDNO.1氨基酸序列，氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点，蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点，通过采用N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点，以及以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点，直接采用双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点进行标记酶切，从而在根本上提高了蛋白酶变体在氨基酸层面的酶切处理效率，副产物更少，使之在药学上经过适配性连接之后的应用更加广泛，并且使得所得蛋白酶变体的适应性更高。蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于起始分子的氨基酸序列，其中起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的SEQ ID NO.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点；所述蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合依然存在，所述蛋白酶的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7‑9个残基。

【技术特征摘要】
1.一种供药学应用的蛋白酶变体，其包含序列表中的SEQIDNO.1氨基酸序列，所述氨基酸序列去除原基因N端前25个氨基酸酶原激活肽段中的前20个氨基酸，N端激活肽剩余序列为肠激酶识别位点，缩短后的酶原序列经EcoRI和NotI双酶切并插入pPIC9K相应的单克隆位点；所述蛋白酶作为起始分子，通过片段化、缺失诱变、插入诱变、或取代诱变而得，并且包含在至少50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、265或266个连续相连氨基酸的长度上相应于所述起始分子的氨基酸序列，其中所述起始分子中含有的氨基酸取代R99E或R99D与氨基酸取代S3T、V4I和V199I的组合依然存在，所述蛋白酶的降解由20S核心颗粒中的β亚基进行，其机制被认为是苏氨酸依赖的亲核攻击，这一机制可能需要有一个结合的水分子参与活性的苏氨酸上羟基的去质子化，降解发生在核心颗粒中间的两个β环内的孔道里，一般不生成部分降解的产物，而是将底物蛋白完全降解为长度一定的肽段，肽段的长度一般为7-9个残基。2.根据权利要求1所述的一种供药学应用的蛋白酶变体，其特征在于：所述蛋白酶活性区氨基酸所在2环及侧翼链，以糖基化识别序列Asn-Xaa-Ser/Thr为模板，选取距离活性位点氨基酸Asp89较近的82位Asn作为拟糖基化位点。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：付信宝，
申请(专利权)人：淄博职业学院，
类型：发明
国别省市：山东,37