一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种新型赖氨酰肽链内切酶，通过合适的柔性连接肽连接酶核心肽、组氨酸标签和精氨酸末端，使其在维持原有酶活性同时既能通过ELISA方法检测样品中纳克级残留的酶，又可以使用离子交换层析纯化得到新型赖氨酰内切酶纯品。本发明专利技术还提供了该酶的一种制备方法，1L发酵液经纯化后可达到107mg新型赖氨酰肽链内切酶纯品的回收量，具有工业化的潜力。

A Novel Lysinoyl Peptide Endonuclease and Its Preparation Method

The invention discloses a novel lysyl endonuclease, which can not only detect residual enzymes of nanogram level in samples by ELISA method, but also purify new lysyl endonuclease by ion exchange chromatography through appropriate flexible ligase core peptide, histidine label and arginine terminal. The invention also provides a preparation method of the enzyme. After purification of 1L fermentation broth, the recovery of 107mg new lysyl peptide endonuclease can be achieved, which has the potential of industrialization.

【技术实现步骤摘要】
一种新型赖氨酰肽链内切酶及其制备方法
本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种新的赖氨酰肽链内切酶及其制备方法。
技术介绍
赖氨酰肽链内切酶(Lysylendopeptidase,EC3.4.21.50)又称赖氨酸特异性内切酶、无色杆菌蛋白酶I、赖氨酸内肽酶、赖氨酰内切酶、赖氨酸C端内切酶、Lys-C内切酶，是一种丝氨酸蛋白酶，最初由Masaki等人从土壤细菌中发现并分离得到的。赖氨酰肽链内切酶具有高度特异性，可特异性切割肽链中赖氨酸残基和S-氨乙基半胱氨酸残基羧基端的肽键。赖氨酰肽链内切酶还具有以下显著特点：1)比牛胰蛋白酶的活性高10倍；2)具有广泛的pH耐受性(pH8.5-10.5)；3)更强的表面活性剂耐受性，如在含4mol/L尿素或0.1％SDS的溶液中保持全酶活性；4)比胰蛋白酶具有更高的底物特异性，胰蛋白酶可以识别和切割赖氨酸和精氨酸，而赖氨酰肽链内切酶通常只识别和切割赖氨酸，因此能显著提高酶切转化率和产物纯度。由于这些特点，赖氨酰肽链内切酶在蛋白序列分析(如质谱分析)、蛋白组学研究(如肽图谱分析)和生物制药(如胰岛素原的酶切)、Lys-X化合物酶催化合成等领域具有重要应用价值。而目前所使用的赖氨酰肽链内切酶存在着以下的问题和缺点：1.利用野生菌表达赖氨酰肽链内切酶时表达水平太低，无法满足工业化需求。虽然使用野生经诱变选育得到的突变菌株在一定程度上提高表达水平，但是突变菌株稳定性不高，存在回复突变的风险。CN103865836A“一株产酶溶杆菌突变菌株及其制备方法”中公开了一株通过自然选育得到产酶溶杆菌菌株L.enzymogensPGJZC30，后再经太空诱变育种得到的表达量最高的突变菌株L.enzymogensTGJZC-041。该菌株使用50L发酵罐发酵培养3天，表达量为1.3U/mL，经纯化后获得390mg的Lys-C，即产量为7.8mg/L。2.为了克服野生菌表达水平低的缺点，人们使用大肠杆菌等工程菌株制备重组赖氨酰肽链内切酶，但是产量没有明显提高，重组赖氨酰肽链内切酶的比活反而有所降低。US5248599A和EP0387646B1公布了一种使用重组大肠杆菌制备赖氨酰肽链内切酶的方法。该方法使用大肠杆菌表达赖氨酰肽链内切酶酶原，并利用大肠杆菌自身修饰加工系统使酶原自我激活，形成具有活性的成熟酶，1L发酵液可获得1.6mg的重组赖氨酰肽链内切酶纯品。CN105950593A“一种赖氨酰肽链内切酶的原核重组表达与制备方法”公布了一种利用大肠杆菌制备重组赖氨酰肽链内切酶的方法。该方法使用重组大肠杆菌表达重组赖氨酰肽链内切酶酶原，产物以包涵体形式存在，经过变性、复性、激活、硫酸铵沉淀、亲和层析、超滤和过凝胶过滤层析获得重组赖氨酰肽链内切酶纯品。每1L发酵体系获得的包涵体经变性可获得1888mg的酶原，经纯化可获得36.61mg的重组赖氨酰肽链内切酶纯品，回收率为1.9％。3.在生物制药领域使用传统的赖氨酰特异性内切酶时，无法使用高灵敏方法检测药物中赖氨酰肽链内切酶的残留量。采用高效液相色谱法检测中间体以及原料药中赖氨酰肽链内切酶残留量，其检测限只能达到μg级别，且不能检测到赖氨酰肽链内切酶自身降解条带；蛋白电泳法能检测到赖氨酰肽链内切酶自身降解条带，但检测限也只能达到μg级别；赖氨酰肽链内切酶ELISA检测试剂盒开发成本高，且目前尚无商业化的ELISA试剂盒可以用于检测赖氨酸内肽酶的残留。4.常规的赖氨酰肽链内切酶酶原的纯化方法是采用亲和层析，而无法使用成本更低的离子交换层析。因而，开发一种新型的赖氨酰肽链内切酶是非常有必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种赖氨酰肽链内切酶及其制备方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种赖氨酰肽链内切酶，该酶的结构为：赖氨酰肽链内切酶核心-连接肽-组氨酸标签-连续的精氨酸。作为上述赖氨酰肽链内切酶的进一步改进，赖氨酰肽链内切酶为选自铜绿假单胞来源的、无色杆菌来源的或产酶溶杆菌来源的其中一种赖氨酰肽链内切酶；作为上述赖氨酰肽链内切酶的进一步改进，连接肽为柔性连接肽，选自GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GGSGGGSGGGGS、GGSGGGSGGGGSGGGGGS中的一种；作为上述赖氨酰肽链内切酶的进一步改进，组氨酸标签为4-8个连续的组氨酸，优选为6个；作为上述赖氨酰肽链内切酶的进一步改进，连续的精氨酸为2-6个精氨酸，优选为2-4个；作为上述赖氨酰肽链内切酶的进一步改进，该酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。一种上述赖氨酰内切酶的制备方法：1)构建含有该赖氨酰肽链内切酶编码基因的重组载体；2)将重组载体导入大肠杆菌宿主细胞，得到重组大肠杆菌细胞；3)对重组大肠杆菌细胞进行发酵培养，收集经诱导表达后的重组大肠杆菌细胞；4)高压均质破碎步骤3)得到的重组大肠杆菌细胞，得到含有新型赖氨酰肽链内切酶的细胞悬液；5)对含有新型赖氨酰肽链内切酶的细胞悬液进行纯化、冷冻干燥，得到赖氨酰肽链内切酶粉末。作为上述制备方法的进一步改进，步骤1)中所述重组载体包含T7启动子或T7lac启动子、编码权利要求1所述的赖氨酰肽链内切酶的多核苷酸分子以及位于所述多核苷酸分子下游的T7终止子，其中所述多核苷酸分子位于所述启动子的下游；作为上述制备方法的进一步改进，步骤3)中所述诱导剂为0.3mM的IPTG；作为上述制备方法的进一步改进，步骤5)中所述纯化方法为高压均质、离子交换层析。本专利技术的有益效果是：本专利技术提供了一种新型赖氨酰肽链内切酶，该酶的C末端带有组氨酸标签，可通过His标签ELISA检测试剂盒检测样品中纳克级残留的酶，特别适用于生物制药领域；酶核心肽和组氨酸标签之间通过合适的柔性连接肽连接，既保留了组氨酸标签的功能，又保证新型赖氨酰肽链内切酶具有野生型赖氨酰肽链内切酶全酶活性。本专利技术的酶可以使用离子交换层析纯化得到新型赖氨酰内切酶纯品，与传统纯化方法相比，物料用量少，大幅度降低了生产成本，具有一定的工业应用价值。本专利技术还提供了该新型赖氨酰肽链内切酶的制备方法，该方法具有高产量的有益效果，经7.5L发酵罐培养时，表达量可以达到2280AU/L，1L发酵液经纯化后获得107mg新型赖氨酰肽链内切酶纯品，高于目前文献报道水平。附图说明图1是pGBCETS质粒图谱；图2是赖氨酰肽链内切酶发酵样品电泳图；图3是用His标签ELISA检测试剂盒检测赖氨酰肽链内切酶结果；图4是用野生型赖氨酰肽链内切酶和新型赖氨酰肽链内切酶酶切门冬胰岛素前体效果对比图。具体实施方式本专利技术通过构建基因工程菌株并进行高密度发酵，得到含有新型赖氨酰肽链内切酶的发酵液，再对其酶活进行检测分析。1)构建基因工程菌株：人工合成新型赖氨酰肽链内切酶的编码基因，用限制性内切酶NdeI和EcoRI(购自NEB公司)进行酶切，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(购自TIANGEN)回收基因片段，然后与经NdeI和EcoRI酶切的表达载体pGBCETS(图1)进行连接，转化大肠杆菌TOP10获得转化子，用通用引物T7promoterprimer和T7terminatorprimer进行测序鉴定，得到重组表达载体。用氯化钙法将重组表达载体转化到大肠杆菌BL21(DE3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，该酶的结构为：赖氨酰肽链内切酶核心‑连接肽‑组氨酸标签‑连续的精氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，该酶的结构为：赖氨酰肽链内切酶核心-连接肽-组氨酸标签-连续的精氨酸。2.根据权利要求1所述的一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，所述赖氨酰肽链内切酶为选自铜绿假单胞来源的、无色杆菌来源的或产酶溶杆菌来源的其中一种赖氨酰肽链内切酶。3.根据权利要求1所述的一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，所述连接肽为柔性连接肽，选自GGGGS、GGGGSGGGGS、GGGGSGGGGSGGGGS、GGSGGGSGGGGS、GGSGGGSGGGGSGGGGGS中的一种。4.根据权利要求1所述的一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，所述组氨酸标签为4-8个连续的组氨酸，优选6个。5.根据权利要求1所述的一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，所述连续的精氨酸为2-6个精氨酸，优选2-4个。6.根据权利要求1所述的一种赖氨酰肽链内切酶，其特征在于，该酶的氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。7.一种如权利要求1所述的赖...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖红星，马文柱，夏玉平，姚元锋，雷春红，肖拥军，罗湘冀，
申请(专利权)人：珠海冀百康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44