改善的分选酶制造技术

本文报道包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90％同一的氨基酸序列且包含突变D101S和K137S的分选酶。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改善的分选酶本专利技术属于分选酶领域。本文报道具有改善的酶活性的分选酶及在转酰胺基反应中使用该具有改善的酶活性的分选酶的方法。
技术介绍
分选酶A(SrtA)是将蛋白质共价附着至细菌细胞壁的膜结合酶。SrtA底物上的特异性识别基序是LPXTG，由此该酶在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割。肽聚糖上的识别基序是五甘氨酸基序。已显示N端上的三甘氨酸和甚至二甘氨酸基序足以支持SrtA反应(Clancy,K.W.等,Peptidescience94(2010)385-396)。反应通过硫酯酰基-酶中间体进行，该中间体通过来自寡聚甘氨酸的胺亲核体的攻击而分解，将肽聚糖共价连接至蛋白质底物，并再生SrtA。SrtA可以用于将化学合成的肽共价缀合至重组表达的蛋白质。WO2010/087994中报道了用于连接的方法及其用途。Marvin,J.S.等(ActaPharmacol.Sinica26(2005)649-658)报道了IgG样双特异性抗体的重组方法。WO2013/003555中报道了用分选酶安装点击化学把手进行蛋白质连接。Levary,D.A.等报道了分选酶A催化的蛋白质-蛋白质融合(PLOSONE6(2011))。Madej,M.P.等(Biotechnol.Bioeng.109(2012)1461-1470)报道了将抗表皮生长因子受体抗体改造为单链型式，并通过分选酶A介导的蛋白质连接进行标记。Ta,H.T.等报道了酶促单链抗体标记作为心血管疾病中靶分子成像和细胞归巢的通用方法(Cir.Res.109(2011)365-373)。Popp,M.等报道了产生和断裂肽键——使用分选酶的蛋白质改造(Angew.Chem.Int.Ed.Eng.50(2011)5024-5032)。WO2010/099536中报道了对DOTA螯合物具有高亲和力的改造蛋白质。已报道了阻断分选酶的逆反应的不同努力。Yamamura,Y.等(Chem.Commun.47(2011)4742-4744)报道了通过在底物识别位点附近引入β-发夹，在连接位点附近诱导β-发夹结构来增强分选酶A介导的蛋白质连接。Biswas,T.等(Biochem.53(2014)2515-2524)报道了通过原型分选酶A分选LPXTG肽、不变底物残基在调节酶动力学中的作用及生产底物的构象特征。Li,Y.M.等报道了通过使用分选酶来使蛋白质发生不可逆位点特异性肼解(Angew.Chem.Int.Ed.Engl.53(2014)2198-2202)。US9,267,127中报道了显示增强的反应动力学和/或改变的底物偏好的进化分选酶及使用这类进化成键酶的方法。其中报道了包含与金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)分选酶A的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列的分选酶，其中分选酶的氨基酸序列包含选自P94S、P94R、E106G、F122Y、K154R、D160N、D165A、G174S、K190E和K196T的两个或多个突变。WO2014/70865和WO2015/42393中使用相同的进化分选酶。Chen,I.等报道了用酵母展示进化成键酶的一般策略(Proc.Natl.Acad.Sci.USA108(2011)11399-11404)。专利技术概述本文报道具有改善的催化特性的金黄色葡萄球菌分选酶A。已发现，通过将突变D160S和K196S引入SEQIDNO:01的野生型金黄色葡萄球菌分选酶A，可以改善该分选酶的催化特性(例如术语D160S指将EQIDNO:01的160位的氨基酸残基D替换/突变为氨基酸残基S)。本文报道的分选酶具有5倍于来自金黄色葡萄球菌的野生型分选酶A的催化活性的催化活性(在本文所述测定中测定)。本文报道的一个方面是分选酶，其包含与氨基酸序列SEQIDNO:11至少90％同一的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含突变D101S和K137S，其中该分选酶在分选酶介导的偶联反应中具有比具有氨基酸序列SEQIDNO:11的分选酶高的催化活性(在本文所述测定中测定)。本文报道的一个方面是分选酶，其包含与SEQIDNO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含突变D160S和K196S(产生具有氨基酸序列SEQIDNO:02的分选酶A)。本文报道的一个方面是具有分选酶活性(即催化含有氨基酸序列LPXTG(SEQIDNO:21)的第一化合物和在其N端含有二甘氨酸或三甘氨酸的第二化合物之间的肽键形成)的多肽，其与SEQIDNO:01的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90％同一，其中氨基酸序列包含突变D160S和K196S(产生具有氨基酸序列SEQIDNO:02的分选酶A)。在一个实施方案中，SEQIDNO:01的分选酶/多肽进一步包含选自突变A61E、A61T、E106G、N107W、F144L和G167E的一个或多个突变。在一个实施方案中，该分选酶/多肽包含突变：i)D160S、K196S和E106G(SEQIDNO:03)；或ii)D160S、K196S和N107W(SEQIDNO:04)；或iii)D160S、K196S和F144L(SEQIDNO:05)；或iv)D160S、K196S和G167E(SEQIDNO:06)；或v)D160S、K196S、N107W和F144L(SEQIDNO:07)；或vi)D160S、K196S、F144L和G167E(SEQIDNO:08)；或vii)D160S、K196S、N107W和G167E(SEQIDNO:09)；或viii)D160S、K196S、N107W、F144L和G167E(SEQIDNO:10)。本文报道的一个方面是具有氨基酸序列SEQIDNO:02、或SEQIDNO:03、或SEQIDNO:04、或SEQIDNO:05、或SEQIDNO:06、或SEQIDNO:07、或SEQIDNO:08、或SEQIDNO:09、或SEQIDNO:10的分选酶/多肽。本文报道的一个方面是分选酶，其包含与SEQIDNO:11的缩短的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90％同一的氨基酸序列，其中该氨基酸序列包含突变D101S和K137S(产生具有氨基酸序列SEQIDNO:12的缩短的分选酶A)。本文报道的一个方面是具有分选酶活性(即催化含有氨基酸序列LPXTG(SEQIDNO:21)的第一化合物和在其N端含有二甘氨酸或三甘氨酸的第二化合物之间的肽键形成)的多肽，其与SEQIDNO:11的金黄色葡萄球菌分选酶A的氨基酸序列至少90％同一，其中氨基酸序列包含突变D101S和K137S(产生具有氨基酸序列SEQIDNO:02的分选酶A)。在一个实施方案中，SEQIDNO:12的分选酶/多肽进一步包含选自突变A2E、A2T、E47G、N48W、F85L和G108E的一个或多个突变。在一个实施方案中，该分选酶/多肽包含突变：i)D101S、K137S和E47G(SEQIDNO:13)；或ii)D101S、K137S和N48W(SEQIDNO:14)；或iii)D101S、K137S和F85L(SEQIDNO:15)；或iv)D101S、K137S和G108E本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.分选酶，其包含与氨基酸序列SEQ ID NO:11至少90％同一的氨基酸序列，其中氨基酸序列包含突变D101S和K137S，其中分选酶在分选酶介导的偶联反应中具有比具有氨基酸序列SEQ ID NO:11的分选酶高的催化活性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.03.30 EP 16162916.71.分选酶，其包含与氨基酸序列SEQIDNO:11至少90％同一的氨基酸序列，其中氨基酸序列包含突变D101S和K137S，其中分选酶在分选酶介导的偶联反应中具有比具有氨基酸序列SEQIDNO:11的分选酶高的催化活性。2.权利要求1的分选酶，其进一步包含选自突变A2E、A2T、E47G、N48W、F85L和G108E(位置基于SEQIDNO:11)的一个或多个突变。3.权利要求1或2中任一项的分选酶，其中分选酶包含突变：i)D101S、K137S和E47G；或ii)D101S、K137S和N48W；或iii)D101S、K137S和F85L；或iv)D101S、K137S和G108E；或v)D101S、K137S、N48W和F85L；或vi)D101S、K137S、F85L和G108E；或vii)D101S、K137S、N48W和G108E；或viii)D101S、K137S、N48W、F85L和G108E。4.权利要求1至3中任一项的分选酶，其中氨基酸序列是SEQIDNO:12、或SEQIDNO:13、或SEQIDNO:14、或SEQIDNO:15、或SEQIDNO:16、或SEQIDNO:17、或SEQIDNO:18、或SEQIDNO:19、或SEQIDNO:20。5.用于产生多肽的方法，其包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·伯尼茨杜拉特，M·沙特，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH