一种工业化生产凝乳酶的方法技术

本发明专利技术公开一种工业化生产凝乳酶的方法，步骤是：用原始菌株作传代菌株制备；活化液培养；种子培养；发酵种子培养；发酵培养；发酵结束，检测参数，放料离心处理，得到湿菌体；湿菌体溶解，再清洗，然后离心收集；菌体悬浮液破碎，离心收集包涵体；包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品。本发明专利技术的工业化生产凝乳酶的方法，1、发酵工艺简单，高密度发酵产量大，成本低；2、细胞破碎工艺减少了固体菌渣带来的环境污染问题；3、膜处理技术效率高，成本低，易操作，减少了传统物理化学工艺带来的产品二次污染问题；4、除菌工艺对产品的保存有极大的作用。

A method for industrial production of chymase

The invention discloses a method for industrialized production of chymosin steps: preparation of the original strain passaged strains; activated liquid culture; seed culture; fermentation seed culture; fermentation; the end of fermentation, testing parameters, discharge centrifugal treatment, get wet cell; wet cell dissolved, washed, and then centrifuged to collect; the cell suspension was broken, the inclusion body was collected by centrifugation; inclusion body after renaturation by rennet liquid; rennet liquid by membrane filtration, water elution, microfiltration purification, ultrafiltration, degerming and filtering to obtain sterile liquid products. The method of the invention of industrialized production of chymosin, 1, fermentation process is simple, high density fermentation and high yield and low cost; 2, cell crushing process reduces the environmental pollution brought by solid residue; technical efficiency 3, film processing high, low cost, easy operation, reduce pollution two problems of traditional physics the process of chemical products; 4, sterilization process has great effect on the preservation of product.

【技术实现步骤摘要】
一种工业化生产凝乳酶的方法
本专利技术涉及食品深加工
，具体地说涉及一种工业化生产凝乳酶的方法。
技术介绍
凝乳酶chymosin一般也称为rennin,是一种蛋白酶，目前来源有小牛皱胃酶、植物提取物、微生物来源。凝乳酶是干酪制作过程中首要催化剂，起到不可或缺的作用，传统工艺中选择动物来源的小牛皱胃酶，但是该来源的酶供不应求，价格昂贵，产量有限，随着生物技术的发展，不少研究者从产凝乳酶菌株中获得凝乳酶，通过微生物的高密度发酵制得凝乳酶，来取代小牛皱胃酶，成为该产业中凝乳酶的供应者。总体来说，动物来源的凝乳酶生长比较慢，来源有限；植物来源的凝乳酶有较高的蛋白水解活性和本身有毒，所以未出现大规模的商业化应用；微生物来源的凝乳酶来源广泛，目前有几十种微生物可用来发酵生产凝乳酶，主要涉及放线菌，细菌和真菌等等；微生物发酵成本低廉，安全无毒，产量大等优点被广泛使用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对上述现有技术的缺陷，提供一种工业化生产凝乳酶的方法，利用细菌-大肠杆菌发酵生产凝乳酶，具有周期短，成本低，易纯化，酶活力高，产业化简单等优势。凝乳酶易纯化，产量大，易规模化生产，可以取代动物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，该方法的步骤是：S1、以来源于大肠杆菌K‑12的发酵菌株为原始菌株；S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28‑30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24‑30小时；S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28‑30℃、180rpm摇床，16‑24小时；S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％‑2％接种,用种子培养基培养，28‑30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2‑5，培养时间8‑12h；S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，...

【技术特征摘要】
1.一种工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，该方法的步骤是：S1、以来源于大肠杆菌K-12的发酵菌株为原始菌株；S2、传代菌株制备：将原始菌株划线在固体平板上，28-30℃恒温培养箱用固定平板培养基培养24-30小时；S3、活化液培养：从平板内挑选单菌落分别接入准备好的三角瓶中，用活化培养基培养，28-30℃、180rpm摇床，16-24小时；S4、种子培养：从活化液中挑选长势较好的菌落转接到大瓶培养，扩大种量，接种量按照1％-2％接种,用种子培养基培养，28-30℃、180rpm摇床培养，活化转接要求OD值为2-5，培养时间8-12h；S4、发酵种子培养，用饱和蒸汽对发酵种子培养基进行灭菌消毒，降温到35-38℃，接种量按照1％-2％接种，开启搅拌220rpm，调节通气量1:1VVM，氢氧化钠调节PH值控制在6.7-7.5，培养时间8-12h，控制OD值在2-5转接；S5、发酵培养：按照接种量1％-1.5％接入发酵培养基中，在36-37℃，开启搅拌,通气量按照溶氧条件调节，培养18-24小时；S6、发酵结束，检测菌体含量、湿重、OD值，放料离心处理，收集得到湿菌体，并计重；S7、湿菌体MEDT溶解，再用EDTA缓冲液清洗菌体，然后离心收集菌体，计重后用EDTA溶解成悬浮液；S8、菌体悬浮液在800-1000Bar高压均质机破碎2次以上，检测OD值在50-65左右时，再次离心收集包涵体；S9、包涵体经过复性，得到粗制凝乳酶液；S10、粗制凝乳酶液经过膜过滤、加水洗脱，微滤除杂、超滤浓缩、除菌过滤得到无菌液态产品；S11、根据客户需求用无菌水配制要求的酶活。2.如权利要求1所述工业化生产凝乳酶的方法，其特征在于，，所述发酵培养的具体步骤为：S5.1、配置发酵培养基，用饱和蒸汽120-122℃灭菌，然后降温到37℃备用；S5.2、按照接种量1％-1.5％将凝乳酶种子移种发酵培养基中，在36-37℃下开启搅拌，起始通气量500(1:1vvm)M3/h,利用氢氧化钠和盐酸控制PH值在6.7-7.5左右，罐压0.02-0.05Mpa,培养时间4-5h；S5.3、培养期间检测OD、湿重、氨基氮、甘油含量指标，当OD超...

【专利技术属性】
技术研发人员：许建立，洪振农，
申请(专利权)人：中诺生物科技发展江苏有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32