双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母及其制备方法技术

本发明专利技术涉及双亲灭活原生质体融合法构建枸杞酿酒酵母及其制备方法，融合菌株枸杞酿酒酵母保藏编号为CGMCC16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心。安琪酵母发酵枸杞能力较强，但发酵后酒体较平淡，香气不足；而BY酵母酒香浓郁、酒体丰满，但发酵枸杞能力差，发酵周期长、酒精度不高。本发明专利技术应用热‑紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，融合后得到一株酵母，同时具有二者的优点，即获得新的具有发酵枸杞能力较强且酒香浓郁的融合菌株。融合菌株发酵的枸杞酒，在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒。

Construction of Lycium barbarum Saccharomyces cerevisiae by parent Inactivated Protoplast Fusion and its preparation method

The present invention relates to the construction of Lycium barbarum Saccharomyces by parents Inactivated Protoplast fusion method and its preparation method. The preservation number of Lycium barbarum Saccharomyces is CGMCC16558, and the preservation date is October 9, 2018. The preservation unit is the general microbial Center for the preservation of Chinese microbial strains. Angel yeast has strong ability to ferment Lycium barbarum, but after fermentation, the wine body is relatively flat and the aroma is insufficient; while BY yeast wine is rich in aroma and full-bodied, but the ability to ferment Lycium barbarum is poor, the fermentation cycle is long and the alcohol content is not high. The invention applies heat-ultraviolet to inactivate the parents, constructs the genes and advantages of the two strains in a new strain cell through the principle of damage complementarity, and obtains a yeast after fusion. At the same time, it has the advantages of both, namely, obtains a new fusion strain with strong fermentation ability and strong wine flavor. Lycium barbarum wine fermented by fused strains was significantly higher than that fermented by Angel yeast in fruit and flower aroma.

【技术实现步骤摘要】
双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母及其制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一株双亲灭活原生质体融合法构建的枸杞酿酒酵母
技术介绍
枸杞子药食同源的历史悠久，是驰名中外的名贵中药材，早在《神农本草经》中就被列为上品，称其为“久服轻身不老、耐寒暑”；有延衰抗老的功效，又名“却老子”。适合所有人食用，含有丰富的营养成分和药理活性成分，具有较高的食用价值，是理想的健身佳品。宁夏是枸杞的主产区，利用枸杞发展枸杞酒酿造业有着很好的发展前景，以枸杞等水果为原料酿造的果酒，酒度低，酒质沮和爽口，果香味浓，营养价值高，基本保持了水果中的天然营养成分，并且富含人体所需的各种氨基酸，多种维生素及矿物质，是所有酒品中具有很大发展前途的酒种。发酵型枸杞酒是集天然、营养、滋补于一体的高品位功能性保健饮品，具有巨大的经济价值和市场潜力。酿造枸杞酒所使用酵母多为葡萄酒酵母，并不真正适宜发酵枸杞，虽有些关于发酵型枸杞酒酵母选育的报道，但多是从耐酒精度、耐糖、起酵速度快等方面出发的，没有考虑如何提高发酵后酒的香气，对酒的品质没有明显提高。因此，需要制备一种适宜发酵枸杞的酵母菌种。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株及其制备方法和应用。本专利技术运用双亲灭活原生质体融合技术构建优良菌株，在发酵枸杞汁实验中分别筛选出两株酵母，一株适宜发酵枸杞，另一株产香性能好，酒香、果香浓郁，将这两株选出的酵母进行原生质体融合，得到一株同时具有两株酵母优点的酵母菌。融合子发酵的枸杞酒，在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒；但草药味略有增加，而脂肪味却明显减少。为解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株，所述融合菌株为枸杞酿酒酵母-18(Saccharomycescerevisiae)，保藏编号为CGMCC16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术还提供了双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，包括以下步骤：(1)两亲本菌体的制备：将安琪酵母和BY酵母接种到斜面完全培养基，活化后立即取菌一环株于100ml麦芽汁培养基中培养至对数期，制得两亲本菌体；(2)两亲本原生质体的制备：向步骤(1)中制备的安琪酵母亲本菌体和BY酵母亲本菌体分别添加1％质量浓度蜗牛酶酶解，作用时间30min，温度30℃。分别制得含有安琪酵母原生质体和BY酵母原生质体的悬浮液；(3)两亲本原生质体的融合：取步骤(2)中制备的安琪酵母原生质体悬浮液采用紫外灯照射，使安琪酵母原生质体完全被灭活；取步骤(2)中制备的BY酵母原生质体悬浮液加热处理，使BY酵母原生质体完全被灭活；取灭活的两亲株原生质体,融合条件为PEG(分子量6000)浓度35％、CaC12浓度10mmol/l、作用时间20-30min、作用温度35℃得到融合的原生质体；(4)融合子的再生：取步骤(3)中融合后的原生质体涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4d，得到再生的融合子；(5)融合子的筛选：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养2-3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落，然后再将选出的菌培养2-3天后再用重氮染色平板法筛选出颜色浅的菌株，复筛选出枸杞发酵能力强且产酒香物质多的稳定融合子。优选的，所述TTC平板法为：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的再生的融合子用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养2-3天后，选择菌落数为300的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2-3小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。优选的，所述重氮染色平板法为：将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养箱内培养48小时，待长出小菌落后将含有0.25％的1-乙酸萘酯、0.25％固蓝盐B和1.5％琼脂的0.50mol/L，pH为4.0的醋酸盐缓冲液倾注于平板上，选取乙酸异戊酯产量高的颜色浅的菌株。优选的，步骤(1)中，麦芽汁培养基中培养条件为，28℃，200rpm培养24-48小时。优选的，步骤(2)中，添加蜗牛酶酶解条件为：温度30℃，作用时间20-30min。优选的，步骤(3)中，紫外灭火的条件为：在10W功率的紫外灯照射6-8min，垂直照射距离为20cm，使安琪酵母原生质体完全被灭活。优选的，步骤(3)中，加热灭活的条件为：在55℃水浴中处理10-12min时，使BY酵母原生质体完全被灭活优选的，双亲灭活酵母原生质体融合菌株在枸杞酒发酵中的应用。专利技术原理：本专利技术应用热-紫外灭活两亲本，通过损伤互补原理将两个菌株的基因和优势构建在一个新的菌株细胞内，获得新的具有发酵枸杞能力较强且酒香浓郁的融合菌株。有益效果本专利技术通过利用双亲灭活酵母原生质体的方法，制备出一株同时具有两株酵母优点的酵母菌。在遗传性上比较稳定，并且融合子发酵的枸杞酒，酒精度高，草药味略有增加，脂肪味明显减少。在果香、花香等方面明显高于安琪酵母发酵生产的枸杞酒。具体实施方式下面结合具体实施方式，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解，在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法：(1)两亲本菌株的培养斜面上各挑取一环亲本菌株于麦芽汁培养基中培养，28℃，200rpm培养至对数期。(2)两亲本菌株原生质体的制备用麦芽汁培养基培养至对数期后的酵母，添加1％质量浓度蜗牛酶，温度30℃，作用时间20min。热灭活：取原生质体悬液，在55℃下作用不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经热处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养4d，当BY酵母的原生质体悬浮液在55℃水浴中处理10min时，其灭活率可达到100％。紫外线灭活：取原生质体悬液，置于紫外灯(功率：10W；灯距：20cm)下照射不同时间，稀释涂布YEPDS平板，同时以未经紫外线处理的原生质体悬液作对照，28℃倒置培养4d，计算原生质体的存活率。紫外灯照射8min，安琪酵母原生质体的灭活率可达到100％；(3)两亲本菌株原生质体的融合融合条件为PEG(分子量6000)浓度30％、CaC12浓度10mmol/L，添加量为1wt％，作用时间20min、作用温度35℃，融合后涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4d。将紫外线灭活的安琪酵母原生质体和热灭活的BY酵母原生质体，按上述条件进行融合，结果原生质体的融合率为2.2×10-5。(4)融合子的筛选及验证TTC平板法筛选产酒精能力强的酵母：将在麦芽汁培养基中培养了24小时的酵母用无菌水稀释到10-4，10-5，10-6三个梯度，取一滴涂布到下层平板上，30℃倒置培养2天后，选择菌落数为200的平板倒入TTC上层培养基覆盖原有菌落，之后在30℃下避光保温2小时，由菌落的呈色来判定酵母产酒精能力的大小，挑选红色的菌落。重氮染色平板法再筛选产酒香物质多的酵母：将菌株涂布于YEPD平板上，置于28℃培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株，其特征是：所述融合菌株为枸杞酿酒酵母‑18(Saccharomyces cerevisiae)，保藏编号为CGMCC 16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

【技术特征摘要】
1.一种双亲灭活酵母原生质体融合菌株，其特征是：所述融合菌株为枸杞酿酒酵母-18(Saccharomycescerevisiae)，保藏编号为CGMCC16558，保藏日期为2018年10月9日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。2.根据权利要求1所述的双亲灭活酵母原生质体融合菌株的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）两亲本菌体的制备：将安琪酵母和BY酵母接种到斜面完全培养基，活化后立即用接种环取菌一环接种到100ml麦芽汁培养基中，28℃培养恒温摇床培养至对数期，制得两亲本菌体；（2）两亲本原生质体的制备：向步骤（1）中制备的安琪酵母亲本菌体和BY酵母亲本菌体分别添加1％质量浓度蜗牛酶酶解，作用时间20-30min，温度30℃，分别制得含有安琪酵母原生质体和BY酵母原生质体的悬浮液；（3）两亲本原生质体的融合：取步骤（2）中制备的安琪酵母原生质体悬浮液采用紫外灯照射，使安琪酵母原生质体完全被灭活；取步骤（2）中制备的BY酵母原生质体悬浮液加热处理，使BY酵母原生质体完全被灭活；取灭活的两亲株原生质体各5mL混合，4000rpm离心15min，弃上清液，再向沉淀液中加入PEG(分子量6000)浓度35wt％、CaC12浓度10mmol/L，作用时间20-30min，作用温度35℃得到融合的原生质体；（4）融合子的再生：取步骤（3）中融合后的原生质体涂布于YEPDS培养基，28℃倒置培养4天，得到再生的融合子；（5）融合子的筛选：融合子再生后，挑选菌落直径较大的接入液体培养基中，28℃培养2-3天，用TTC法挑选出颜色较红的菌落，然后再将选出的菌培养2-3天后再用重氮染色平板法筛选出颜色浅的菌株，复筛选出枸杞发酵能力强且产酒香物质多的稳定融合子。3.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔长晟，董赛君，张卫，
申请(专利权)人：杞源堂宁夏生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：宁夏,64