增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法技术

在一个方面，本公开主题特征在于一种生产富含EPA的脂质的方法，该方法包括修饰微藻以增加PFA1和/或PFA3的表达，并在允许PFA1和/或PFA3表达的条件下培养该修饰的微藻，其中产生富含EPA的脂质。特征还在于其中过表达PFA1和/或PFA3的重组微藻。本文已经证明此类重组微藻产生极其有利的脂肪酸脂质谱(例如EPA水平增加、EPA:DHA的比例增加，DPA n‑6的水平下降等)。

Method of Increasing the Yield of_-3 Polyunsaturated Fatty Acids in Microalgae

In one respect, the subject matter of the present disclosure is characterized by a method of producing lipids rich in EPA, which includes modifying microalgae to increase the expression of PFA1 and/or PFA3, and culturing the modified microalgae under conditions that allow the expression of PFA1 and/or PFA3 to produce lipids rich in EPA. It is also characterized by recombinant microalgae that overexpress PFA1 and/or PFA3. It has been proved that these recombinant microalgae can produce extremely favorable fatty acid lipid profiles (e.g. increased EPA level, increased proportion of EPA:DHA, decreased DPA n_6 level, etc.).

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸产量的方法相关申请本申请要求于2016年5月12日提交的美国临时专利申请号62/335,498的申请日的权益，将其公开内容通过引用特此并入本文。
本公开文本涉及通过改变编码多不饱和脂肪酸合酶的亚基的基因的表达水平增加微藻中ω-3多不饱和脂肪酸(诸如二十碳五烯酸(EPA))产量的方法。例如，公开了通过增加编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3的表达水平增加EPA产量的方法。本公开文本还涉及经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因(诸如PFA1和/或PFA3)的表达水平的重组微藻。本公开文本还涉及操纵ω-3多不饱和脂肪酸与ω-6多不饱和脂肪酸的比例，诸如操纵微藻中生产的EPA与二十二碳六烯酸(DHA)的比例的方法。专利技术背景破囊壶菌是破囊壶菌目的微生物，包括破囊壶菌属(Thraustochytrium)和裂殖壶菌属(Schizochytrium)的成员，且已被公认为PUFA的重要来源。参见，例如美国专利号5,130,242。已经表明，海洋细菌和破囊壶菌中的聚酮合酶(PKS)样系统能够从乙酰-CoA和丙二酰-CoA合成多不饱和脂肪酸(PUFA)。这些PKS样系统在本文中也称为PUFA合酶系统。海洋细菌希瓦氏菌属(Shewanella)和海洋弧菌(Vibriomarinus)中的PUFA合酶系统描述于美国专利号6,140,486中。裂殖壶菌属的破囊壶菌中的PUFA合酶系统描述于美国专利号6,566,583中。裂殖壶菌属(ATCC20888)和破囊壶菌属(ATCC20892)的破囊壶菌中的PUFA合酶系统也描述于美国专利号7,247,461和7,256,022中。美国专利号7,211,418描述了破囊壶菌属的破囊壶菌中的PUFA合酶系统以及利用该系统生产二十碳五烯酸(C20:5，ω-3)(EPA)和其他PUFA。美国专利号7,217,856描述了奥氏希瓦氏菌(Shewanellaolleyana)和日本希瓦氏菌(Shewanellajaponica)中的PUFA合酶系统。WO2005/097982描述了菌株SAM2179中的PUFA合酶系统。美国专利号7,208,590和7,368,552描述了来自金黄色破囊壶菌(Thraustochytriumaureum)的PUFA合酶基因和蛋白。最近来自裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695的PUFA合酶系统描述于美国专利号8,940,884中。当表达时，来自裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695的PUFA合酶(PFA1、PFA2和PFA3)产生独特的脂肪酸谱，部分特征在于高水平的ω-3脂肪酸。图1中提供了来自裂殖壶菌属物种ATCCPTA-9695的PUFA合酶的基因构造(PFA1、PFA2和PFA3)的示意图。图2中提供了几种上述破囊壶菌中的PUFA合酶的结构域构造示意图。传统上，PKS系统在文献中已被描述为属于三种基本类型之一，通常称为I型(模块化或迭代)、II型和III型。II型系统的特征在于可分离的蛋白，每一种蛋白进行不同的酶促反应。这些酶协作生产最终产物，且该系统的每种单独的酶通常多次参与生产最终产物。这类系统作用方式类似于见于植物和细菌中的II型脂肪酸合酶(FAS)系统。I型迭代PKS系统与II型系统类似，类似之处在于这些酶以迭代方式用于生产最终产物。I型迭代系统与II型系统的不同之处在于，酶活性与可分离的蛋白无关，而是作为较大蛋白的结构域发生。这个系统与见于动物和真菌中的I型FAS系统类似。与II型系统相反，在生产最终产物时只使用I型模块化PKS系统中的每个酶结构域一次。该结构域见于较大蛋白，且将每个反应的产物传递至PKS蛋白的另一结构域。最近已发现了III型系统，且属于缩合酶的植物查耳酮合酶家族。III型PKS系统不同于I型和II型PKS系统，且在迭代缩合反应中使用游离CoA底物，通常用于生产杂环最终产物。在PUFA合成的常规或标准途径中，通过一系列延伸和去饱和反应修饰中等链长饱和脂肪酸(脂肪酸合酶(FAS)系统的产物)。延伸反应的底物是脂肪酰-CoA(待延伸的脂肪酸链)和丙二酰-CoA(每个延伸反应期间添加的两个碳的来源)。延伸酶反应的产物是脂肪酰-CoA，其在直链中具有两个额外的碳。去饱和酶通过提取氧依赖性反应中的两个氢在预先存在的脂肪酸链中产生顺式双键。去饱和酶的底物是酰基-CoA(在一些动物中)或酯化为磷脂(例如磷脂酰胆碱)的甘油主链的脂肪酸。基于碳链的长度和饱和特征对脂肪酸分类。脂肪酸基于链中存在的碳数量称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子之间不存在双键时称为饱和脂肪酸，当存在双键时称为不饱和脂肪酸。不饱和长链脂肪酸在只存在一个双键时是单饱和的，且在存在超过一个双键时是多不饱和的。PUFA基于从脂肪酸的甲基末端开始的第一双键的位置分类：ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一双键，而ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是具有22个碳链长和6个双键的ω-3PUFA，通常命名为“22:6n-3”。其他ω-3PUFA包括二十碳五烯酸(“EPA”)，命名为“20:5n-3”，和ω-3二十二碳五烯酸(“DPAn-3”)，命名为“22:5n-3”。DHA和EPA被称为“必需”脂肪酸。ω-6PUFA包括花生四烯酸(“ARA”)，命名为“20:4n-6”，和ω-6二十二碳五烯酸(“DPAn-6”)，命名为“22:5n-6”。ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于它们存在于细胞膜中，影响细胞生理学，调节生物活性化合物的产生和基因表达，并作为生物合成底物。Roche,H.M.,Proc.Nutr.Soc.58:397-401(1999)。例如，DHA占人类大脑皮层中脂质的大约15％-20％，视网膜中脂质的30％-60％，集中在睾丸和精子中，并且是母乳中的重要组分。Bergé,J.P.,andBarnathan,G.Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.96:49-125(2005)。DHA占脑中ω-3脂肪酸的高达97％，且占视网膜中ω-3脂肪酸的高达93％。此外，DHA对于胎儿和婴儿的发育以及成人认知功能的维持都是必不可少的。同上。因为ω-3脂肪酸不是在人体中从头合成，所以这些脂肪酸必须来源于营养来源。亚麻籽油和鱼油被认为是ω-3脂肪酸的良好膳食来源。亚麻籽油不含EPA、DHA、DPA或ARA，但含有亚麻酸(C18:3n-3)，这是一种能够使身体制造EPA的结构单元。然而，有证据表明，代谢转化的速度可能是缓慢且可变的，特别是在健康受损的人群中。鱼油的脂肪酸组成的类型和水平差异很大，这取决于具体的物种和它们的饮食。例如，通过水产养殖饲养的鱼的ω-3脂肪酸水平往往低于野生鱼。此外，鱼油具有含有环境污染物的风险，并且可能与稳定性问题和鱼腥味或味道有关。已经通过修饰内部产生的脂肪酸努力在油仔作物中生产PUFA。用脂肪酸延长酶和去饱和酶的各种单独基因给这些植物进行遗传修饰已经产生含有PUFA(诸如EPA和DHA)的叶子或种子(Ruiz-Lopez等人,Appl.Microbiol.Biotechn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组微藻，其中该重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、和/或其功能等效物的表达；并且其中当与宿主微藻相比时，该重组微藻产生的脂质中的二十碳五烯酸(EPA)的水平增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.05.12 US 62/3354981.一种重组微藻，其中该重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、和/或其功能等效物的表达；并且其中当与宿主微藻相比时，该重组微藻产生的脂质中的二十碳五烯酸(EPA)的水平增加。2.权利要求1的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以与该宿主微藻相比时增加PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平。3.权利要求2的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，PFA1和/或PFA3的表达增加至少1.5倍。4.权利要求1-3中任一项的重组微藻，其中该微藻是网粘菌纲。5.权利要求4的重组微藻，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。6.权利要求5的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。7.权利要求6的重组微藻，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。8.权利要求1-7中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1的表达。9.权利要求1-8中任一项的重组微藻，其中该重组微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。10.权利要求1-9中任一项的重组微藻，其中该微藻经修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物。11.权利要求1-10中任一项的重组微藻，其中通过源自于该宿主微藻的启动子驱动PFA1和/或PFA3的表达。12.权利要求1-11中任一项的重组微藻，其中该微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因的多个拷贝。13.权利要求10-13中任一项的重组微藻，其中该编码PFA1的基因与SEQIDNO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQIDNO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQIDNO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQIDNO:6至少80％相同的氨基酸序列。14.权利要求12-13中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。15.权利要求12-14中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。16.权利要求12-15中任一项的重组微藻，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。17.权利要求1-16中任一项的重组微藻，其中使内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶基因中的一个或多个缺失。18.权利要求1-16中任一项的重组微藻，其中使内源性多不饱和脂肪酸(PUFA)合酶基因中的一个或多个突变。19.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，该脂质中的EPA增加至少2倍。20.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中相对于该宿主微藻，该脂质富含二十二碳六烯酸(DHA)。21.权利要求1-18中任一项的重组微藻，其中当与该宿主微藻相比时，EPA:DHA比例增加至少2倍。22.一种在微藻中生产富含ω-3PUFA的脂质的方法，其包括：a)修饰该微藻以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3和/或其功能等效物的表达；并且b)培养该经修饰的微藻；其中当与该宿主微藻相比时，产生富含ω-3PUFA的脂质。23.权利要求22的方法，其中该重组微藻经修饰以与该宿主微藻相比时增加PFA1和/或PFA3、或其功能等效物的表达水平。24.权利要求23的方法，其中相对于该宿主微藻，PFA1和/或PFA3的表达增加1.5倍。25.权利要求22-24中任一项的方法，其中该微藻是网粘菌纲。26.权利要求25的方法，其中该网粘菌纲是破囊壶菌。27.权利要求26的方法，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。28.权利要求26的方法，其中该破囊壶菌是裂殖壶菌属。29.权利要求22-28中任一项的方法，其中该微藻经修饰以增加PFA1表达。30.权利要求22-29中任一项的方法，其中该微藻经修饰以增加PFA1和PFA3的表达。31.权利要求22-30中任一项的方法，其中该微藻经修饰以过表达编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物。32.权利要求22-31中任一项的方法，其中通过源自于该宿主微藻的启动子驱动PFA1和/或PFA3的表达。33.权利要求22-32中任一项的方法，其中该微藻经修饰以包含编码PFA1的基因和/或编码PFA3的基因、或其功能等效物的多个拷贝。34.权利要求31-33中任一项的方法，其中该编码PFA1的基因与SEQIDNO:1是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQIDNO:2至少80％相同的氨基酸序列；并且其中该编码PFA3的基因与SEQIDNO:5是至少80％相同的或是编码如下多肽的多核苷酸序列，该多肽包含与SEQIDNO:6至少80％相同的氨基酸序列。35.权利要求33-34中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的2与10个之间的拷贝。36.权利要求33-35中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的3与7个之间的拷贝。37.权利要求33-36中任一项的方法，其中该微藻包含该编码PFA1的基因的4与6个之间的拷贝。38.权利要求22-37中任一项的方法，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个缺失。39.权利要求22-37中任一项的方法，其中使内源性PUFA合酶基因中的一个或多个突变。40.权利要求22-39中任一项的方法，其中ω-3PUFA增加的脂质包含EPA。41.权利要求40的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中的EPA增加至少2倍。42.权利要求22-41中任一项的方法，其中富含ω-3PUFA的脂质包含二十二碳六烯酸(DHA)。43.权利要求42的方法，其中相对于该宿主微藻，EPA:DHA比例增加至少2倍。44.权利要求22-43中任一项的方法，其中相对于该宿主微藻，该脂质中ω-3PUFA:ω-6PUFA的比例增加。45.一种重组微藻，其中该重组微藻经修饰以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2、和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3、和/或其功能等效物；并且其中当与宿主微藻相比时，该重组微藻产生富含ω-3PUFA的脂质。46.权利要求45的重组微藻，其中当与该宿主微藻相比时，该脂质的ω-3PUFA:ω-6PUFA比例增加。47.一种在微藻中产生具有降低的ω-6PUFA水平的脂质的方法，其包括：a)修饰该微藻以改变编码多不饱和脂肪酸合酶的基因的表达水平，包括改变编码多不饱和脂肪酸合酶亚基1(PFA1)的PFA1和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基2(PFA2)的PFA2和/或编码多不饱和脂肪酸合酶亚基3(PFA3)的PFA3和/或其功能等效物的表达；并且b)培养该经修饰的微藻；其中相对于宿主微藻，产生具有降低的ω-6PUFA水平的脂质。48.权利要求47的方法，其中相对于该宿主微藻，...

【专利技术属性】
技术研发人员：AC·V·贝恩，R·E·齐克勒，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：荷兰,NL